3 、使用方法参考

3.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Heparin NUPharoseFF 的压缩比为~1.15，Heparin NUPharose HP 的压缩比为~1.20 。 为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约 3 倍 填料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

3.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

在上样前，可用初始缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱，观察检测器的变化，直到 电导、pH 等参数不变。本产品的缓冲液体系可为磷酸盐、柠檬酸盐和 Tris-HCl 等，浓 度为 10~20 mM ，pH 为 7~8 为宜。

样品通常溶于上述缓冲液 A，或者将样品溶液进行换液处理，置换成缓冲液 A 体 系。上样量可按“mg  目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如 Heparin  NUPharoseFF 产品对rh-aFGF 的DBC10%为~10 mg/mL，纯化时的上样量可为 5~8 mg/mL。 除了 DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。

3.4  洗杂（wash）

在缓冲液 A 中添加一定量的盐对上样后的色谱柱进行冲洗可以抑制非特异性吸附， 从而提高产物纯度。200~600 mM 的 NaCl 是常用的提高离子强度的盐，具体的离子强 度可以通过线性梯度或者阶跃梯度确定。洗杂的体积通常为 3~10 个柱体积。

3.5  洗脱（Elution）

洗脱过程则可以进一步提高缓冲液 A 中的盐浓度，添加 1.5~2 M 的 NaCl 可将目的 蛋白有效洗脱。

3.6  再生与在位清洗（CIP）

        通常可用 5 CV 的洗脱液将填料再生。若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉,可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下选择进行在位清洗：0.1 mol/L NaOH、非离子型 表面活性剂等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。具体的 CIP 溶液选 择可参考下表。

3.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，含 50 mM 醋酸钠，使用过后可继续用相同的保存 液。保存温度在 2~30 ℃为宜，不可冻存。