3 、使用方法参考

3.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。STI NUPharose FF 的压缩比为~1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法， 也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为 67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流 速平衡柱内的填料。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

3.3  平衡与上样

在上样前，可用上样缓冲液（平衡缓冲液）在操作流速下平衡层析柱，观察检测器 的变化，直到电导、pH 等参数不变，一般需 5~10 个 CV（柱体积）。上样量根据样品的 性质和层析介质的量进行选择，可在预实验中确定，例如静态吸附实验。

上样前需通过透析或超滤将样品溶剂置换为上样缓冲液（平衡缓冲液），然后澄清 过滤（0.45 、0.22μm）。

上样缓冲液 pH  通常为 7.0~8.0，可参考使用如下上样缓冲液： 50mM Tris-HCl， 100~500 mM NaCl ，pH8.0。

在去除肠激酶的应用中， 目标蛋白在流穿中，肠激酶被结合在柱上。

3.4  淋洗

用 2-5 个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱，观察检测器的变化，直到电导、 pH 等参数不变，此时未结合的组分被清洗出去。

3.5  洗脱

亲和层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱。一般用酸性缓冲液进行 洗脱。推荐的洗脱缓冲液为：100 mM Glycine-HCl ，500mM NaCl ，pH3.0。洗脱后的样 品应尽快调节至中性，比如加入 1/10 体积的 2M Tris-HCl (pH8.0)。

3.6  再生与在位清洗（CIP）

可以用平衡缓冲液和洗脱缓冲液反复清洗，不耐受强酸、强碱、强有机溶剂的清洗。

3.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~8 ℃ 为宜，不可冻存。