4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。NuPerley Boronate 的压缩比为~1.10。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法， 也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为 67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样

在上样前，可用上样缓冲液（平衡缓冲液）在操作流速下平衡层析柱，观察检测器 的变化，直到电导、pH 等参数不变。上样量根据样品的性质和层析介质的量进行选择， 可在预实验中确定，例如静态吸附实验。一般需要将样品用上样缓冲液稀释，例如 1：

1 稀释。

上样缓冲液 pH 通常为 8.5~9.0，例如将糖蛋白从非糖蛋白中分离可用 HEPES 缓冲 液（20 mM HEPES, 20 mMMgCl2, pH 8.5），从脱氧核糖核苷中分离核糖核苷可用醋酸铵 缓冲液（0.25 M 醋酸铵, pH 8.8）。本填料常用的上样缓冲体系有磷酸盐、醋酸铵、 HEPES 等，一般情况下应避免使用含氨基的缓冲液，例如 Tris-HCl 体系。

4.4  洗脱

用 2-3 个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱，观察检测器的变化，直到电导、 pH 等参数不变，此时未结合的组分被清洗出去。

亲和层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱。洗脱过程可以将 pH 降 低至 4~6，例如 0.1 M  甲酸、25 mM 盐酸；也可以选择糖类进行竞争洗脱，如 10~200 mM 山梨醇；也可以用 0~20 mM 的 EDTA；Tris 可作为高效洗脱剂。

4.5  再生与在位清洗（CIP）

通常可用 5 CV 的洗脱液将填料再生。若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉可用在位清洗（CIP）除去。可采用以下选择进行在位清洗：0.5 mol/L NaOH、70%乙醇、 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。

4.6  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。也可以用 0.2 M 醋酸钠、0.1 M  甲酸等与洗脱、再生接近的缓冲液保存，缓冲液中可添加 0.02%叠氮化 钠以防腐，在偏弱酸性的环境中填料更稳定。保存温度在 2~8 ℃为宜，不可冻存。