金沙990活动大厅-www.990.com|登录入口

NRPB97——NuPerley Boronate

发布日期:2023-10-29 阅读次数:9470

1 、产品介绍

 

NuPerley Boronate 填料是在纽龙生物新一代高刚性琼脂糖凝胶微球骨架的表面设计 特定的间隔臂后,再偶联 3-氨基苯硼酸形成的亲和层析介质。苯硼酸配基在弱碱性条件 下可与 1,2-顺式二醇通过可逆共价键形成硼酸酯,可特异性结合含 1,2-顺式二醇结构的 物质,包括糖蛋白(包括抗体)、酶、多糖、 核苷、核苷酸和儿茶酚等多类生物分子。也 可通过 NADP+ ATP 来辅助分离纯化不能直接与填料结合的目标分子。因特异性高, 且用途广泛,使用本产品的纯化过程可单独归类为硼酸亲和层析(Boronate affinity chromatography BAC)。

2 、产品特点与技术指标

 

产品名称

NuPerley Boronate

目录编号

NRPB97L NRPB97S(预装柱)

基质

高刚性琼脂糖凝胶

配基

3-氨基苯硼酸,~20 μmol/mL

载量

~10 mg IgG/mL

粒径范围 a

30~100 μm

平均粒径

~60 μm

推荐工作流速

150 cm/h

最大流速与压力 b

>1500 cm/h 0.5 MPa

使用 pH

3~10(操作过程),2~13CIP 过程)

化学稳定性

在常用的水相缓冲液、0.5 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿素、30%异丙醇和 70%乙醇等体系中稳定。

储存与运输

20%乙醇,2~8 ℃(储存),2~30 ℃(运输)

保质期

3 

注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;b 10 cm 柱高下的最大测试流速。

3、硼酸亲和原理

 

NuPerley Boronate  1,2-顺式二醇结构形成的可逆共价键(硼酸酯)是层析过程的 主要作用力( 1)。pH=8.5  以上有利于填料与目标分子以硼酸酯的形式结合,但生物 分子的分离纯化较少用到 pH=9.0 以上的条件;pH=4.0~6.0 则有利于硼酸酯的解离。除 了可以降低 pH 将目标分子洗脱,也可以用山梨醇、甘露醇等含 1,2-顺式二醇结构的糖 类进行竞争洗脱。

除了可逆共价键,配基中存在苯环这一疏水基团,可能与含苯环的物质之间存在 π- π 相互作用,这要求上样缓冲液的离子强度不能过高,通常在~50 mM以降低疏水相互 作用造成的非特异性吸附。硼酸酯的四面体结构带负电荷, 为降低离子相互作用造成的 非特异性吸附,又要求结合过程有较高的离子强度。NuPerley Boronate  通常在 50~500 mM 的离子强度下与目标分子有较优的特异性结合。二价阳离子可降低离子相互作用和 疏水相互作用造成的非特异性吸附,例如可在上样缓冲液中加入 0~50 mM  MgCl2  Mg2+也可以抑制填料与核酸等含磷酸基团物质的电荷互斥作用,加入 Mg2+可以增强结 合效果。

当形成的硼酸酯以不带电荷的平面三角形结构存在时,硼原子存在空轨道,可作为 电荷转移相互作用的电子受体。未质子化的氨基是良好的电子供体, 当氨基提供孤对电 子给硼原子时,硼原子形成四面体型,促进硼酸酯的形成。但需要注意的是, 当氨基附 近有羟基存在时,填料与 1,2-顺式二醇将无法形成硼酸酯结构。这也是为什么乙醇胺和 Tris 不适合作为 NuPerley Boronate 的上样缓冲液。

image.png


4 、使用方法参考

 

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。

1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。

2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。NuPerley Boronate 的压缩比为~1.10。为使达到装柱比,可通过柱头下压的方法, 也可以通过高流速压柱。

3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽去液体,并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。

4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液(原包装中填料体积分数为 67%),使用前搅匀。

5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。

6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后,用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。

7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵,打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后,需用高流 速平衡柱内的填料。

 

装柱条件

NuPerley Boronate

压缩比

~1.10

装柱流速

600~1500 cm/h,依赖于色谱柱尺寸,以压缩比和柱 效测试为准

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。

4.3  平衡与上样

在上样前,可用上样缓冲液(平衡缓冲液)在操作流速下平衡层析柱,观察检测器 的变化,直到电导、pH 等参数不变。上样量根据样品的性质和层析介质的量进行选择, 可在预实验中确定,例如静态吸附实验。一般需要将样品用上样缓冲液稀释,例 1

1 稀释。

上样缓冲液 pH 通常为 8.5~9.0,例如将糖蛋白从非糖蛋白中分离可用 HEPES 缓冲 液(20 mM HEPES, 20 mMMgCl2, pH 8.5),从脱氧核糖核苷中分离核糖核苷可用醋酸铵 缓冲液(0.25 M 醋酸铵, pH 8.8)。本填料常用的上样缓冲体系有磷酸盐、醋酸铵、 HEPES 等,一般情况下应避免使用含氨基的缓冲液,例 Tris-HCl 体系。

4.4  洗脱

 2-3 个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱,观察检测器的变化,直到电导、 pH 等参数不变,此时未结合的组分被清洗出去。

亲和层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱。洗脱过程可以将 pH  低至 4~6,例如 0.1 M  甲酸、25 mM 盐酸;也可以选择糖类进行竞争洗脱,如 10~200 mM 山梨醇;也可以用 0~20 mM  EDTATris 可作为高效洗脱剂。

4.5  再生与在位清洗(CIP

通常可用 5 CV 的洗脱液将填料再生。若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉可用在位清洗(CIP)除去。可采用以下选择进行在位清洗:0.5 mol/L NaOH70%乙醇、 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效果更佳。

4.6  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。也可以用 0.2 M 醋酸钠、0.1 M  甲酸等与洗脱、再生接近的缓冲液保存,缓冲液中可添加 0.02%叠氮化 钠以防腐,在偏弱酸性的环境中填料更稳定。保存温度在 2~8 ℃为宜,不可冻存。




上一个:
Baidu
sogou