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分离纯化填料助力抗体研发

发布日期:2023-11-09 阅读次数:448

    制药工具|纽龙生物助力抗体研发

一、抗体的定义和分类

1、抗体:

传统抗体(antibodyAb)是机体的免疫系统在抗原刺激下由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白,由2条重链和2条轻链通过二硫键连接形成。

抗体可以分为两段:Fab段和Fc段,Fab段为抗原结合片段(fragment of antigen bindingFab),由一个完整的轻链和重链的VHCH1结构域组成Fc段为可结晶段(fragment crystallizableFc)相当于IgCH2CH3结构域,是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。Fab段包含完整的可变区,以及恒定区的CH1区域。Fc段仅指Ig恒定区CH2CH3的区域。抗体的可变区(Variable RegionV区)是抗体结合抗原的位置,这些可变区氨基酸的组成和排列决定决定着抗体的抗原特异性。抗体的恒定区(Constant RegionC区)可以与细胞表面受体或补体系统蛋白相互作用,从而触发宿主效应功能,比如裂解入侵细胞或吞噬外来病原。

2、抗体的种类和特性

a天然抗体:

人或动物未经明显感染或人工注射抗原而天然存在于体内的各种抗体,根据重链类型不同,可将其分为五类,即IgGIgMIgAIgEIgD

b多克隆抗体(polyclonal antibodypAb):

天然抗原往往具有多种表位,刺激机体产生的抗体中包含针对多种不同抗原表位的Ig,系由多个B细胞克隆产生的抗体混合物,故称为多克隆抗体。多克隆抗体识别位点多但特异性不高。

c单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb):

由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体,称为单克隆抗体(以下简称单抗),一般通过杂交瘤技术制备,具有结构高度均一、抗原结合部位和同种型相同、纯度高、特异性强和效价高等特点。 单抗发展到现在可以分为四代,分别为:鼠源化单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源化单抗。

d基因工程抗体:

天然抗体在实际应用过程中,由于物种间的差异性,在成药性方面会引起部分人群的过敏或排异反应,从而导致药物开发的失败。基因工程抗体是近些年来,为降低异源性抗体引发排异反应的潜在风险,从而基于基因的分子克隆技术分别表达制备抗体重链和轻链片段,并进一步制备而成的人源化抗体。与杂交瘤技术生产的单克隆抗体相比,重组抗体具有高批间一致性、无动物源生产、易于工程化改造等优势。

e纳米抗体:

纳米抗体是在羊驼外周血液中存在的一种天然缺失轻链抗体,该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2CH3区,但却不像人工改造的单链抗体片段 (scFv) 那样容易相互沾粘,甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,是已知的可结合目标抗原的最小单位,具有结构功能上的独特优势,在疾病诊断、癌症和感染性疾病等方面均展现了良好的防治效果。

二、抗体药分类

抗体药是指利用人工合成的抗体分子来治疗疾病的药物,既有传统抗体多抗、单抗等),又有非传统新型抗体纳米抗体、基因工程抗体等)能够针对特定的疾病进行治疗。具有特异性高、不良反应低等特点,是目前新药研发的主要领域。依据抗体的特征及制备过程,可以分为单抗、双抗、ADCFc融合蛋白、抗体片段等等。

1、单克隆抗体

单克隆抗体药物是抗体类药物中最重要的一类。1975年英国科学家Milstein和法国科学家Kohler将产生抗体的B淋巴细胞同肿瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具备亲本细胞的特性,既可以产生抗体,又具有肿瘤细胞无限增殖的特性,从而持续分泌单抗。单抗优点众多,在抗体临床应用过程中具有划时代的意义,两位科学家因此被授予1984年的诺贝尔生理学或医学奖。之后单抗经历了鼠源化单抗、人鼠嵌合单抗、人源化单抗和全人源单抗等不同发展阶段

a.鼠源化单抗:

1986年,第一个被美国FDA批准的单抗药Orthoclone OKT3问世,用于防止肾脏移植后的宿主排斥反应。OrthocloneOKT3来自于小鼠,是第一代鼠源化单抗,用于人身上会有强烈的免疫反应,人体产生的免疫排斥使单抗药很快从病人体内被清除掉,大大降低了它们应有的疗效,尤其在治疗慢性疾病需要长期服用的情况下,鼠源化单抗药在后续注射时疗效甚微,因此,早期单抗药的市场表现并不尽人意。

b.人鼠嵌合单抗:

20世纪90年代,为了解决鼠源化抗体的差异化问题,科学家提出了人源化抗体的概念。采用抗体蛋白工程技术,对小鼠单抗的部分氨基酸序列进行置换,或加以拼接,获得既不引起人免疫排斥,又不降低对抗原的亲和性的重组抗体。人鼠嵌合抗体是指用人抗体的恒定区取代小鼠的恒定区,约33%的氨基酸序列来自小鼠,其余67%序列为人源的序列。人鼠嵌合单抗相比鼠源化单抗,免疫原性大幅下降,因此副作用降低,半衰期加长,但是由于人鼠嵌合抗体仍保留了30%左右的鼠源序列,还是会引起一定程度的免疫反应。 

c.人源化单抗:

为了进一步降低抗体的鼠源性,人们又开发了重构抗体技术生产重构人源化抗体。人源化抗体中人源序列的比例可以高达90%,即拿到针对某抗原的小鼠抗体后,只取其识别抗原的区域(CDR区域),移植到人源抗体中。人源化单抗比人鼠嵌合单抗更有优势,引起免疫排斥或超敏的风险更低。但是目前缺乏通用的制备方法,每个抗体分子的人源化,都需要个案分析、分子建模、大量的改造和试错,而且由于鼠源序列的存在,还是不能完全避免免疫排斥或超敏的风险。

d.全人源化单抗:

全人源化单抗是100%人源性抗体,它是用于人类疾病治疗的理想抗体。随着重组DNA技术的发展,各种抗体人源化技术迅速发展,譬如噬菌体展示文库和转基因小鼠技术等的成熟应用,使全人源化单抗的产生成为可能,2002年第一个全人源化抗体阿达木单抗(艾伯维)上市。

简而言之,噬菌体展示技术先通过PCR技术建立一个以噬菌体基因组为载体的、表达无数个人源抗体可变区的基因库。当大肠杆菌被转染后,千百万个噬菌体被释放出来,每个噬菌体表面呈现一个独特的抗体可变区片断。含有这些噬菌体混合物的溶液,在流过附着特定抗原的固态基质后,粘在基质表面,无法被清洗的往往是呈现特异性抗体的噬菌体颗粒,特异性抗体的基因再进一步被扩增、纯化即可得到目标抗体的信息。

转基因小鼠技术通过转基因手段把人的抗体基因片段转入小鼠体内,并进行有效的重排和表达,这些片段能与小鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用,使得小鼠在受抗原刺激后,表达并活化 B 细胞分泌人抗体。基于这种技术制备的抗体,具有较高的靶结合亲和力,同时,用转基因小鼠生产候选抗体药物时间较短,费用较低,较于传统方式具有一定的技术优势。

2、双特异性抗体 

双特异性抗体(以下简称双抗)是含有两个特异性抗原结合位点的人工抗体,其中一个位点可与靶细胞表面抗原结合,另一个位点则可与载荷物(如效应细胞,分子等)结合。通过同时识别两个标靶,双抗可以作为一个媒介双重定向免疫效应细胞,如自然杀伤细胞和T细胞,加强对肿瘤细胞的杀伤功能。如Trion Pharma公司的卡托索单抗和安进公司的倍利妥等。

3、抗体偶联药物(antibody drug conjugate, ADC 

抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单抗与小分子细胞毒性药物通过连接子偶联形成,通过mAb对肿瘤细胞的特异性使得小分子药物在肿瘤组织发挥作用,能够有效降低传统小分子药物高毒副作用并提高整体治疗效率。ADC可以结合抗体的高特异性和小分子化学药的有效性。ADC由三部分构成:抗体、小分子药物和连接臂。抗体要有高度的靶向特异性,识别细胞表面抗原后,还能诱导细胞内吞,将整个复合物内吞到溶酶体内,复合物在溶酶体内被分解后,将小分子药物释放出来发挥作用。这种药物运输体系能够改善小分子化学药物的代谢动力学,提高药物的特异性,减少副作用。但ADCs的开发有一定的技术困难,特别是连接臂的构建。

4Fc融合蛋白 

Fc融合蛋白也是基于传统单抗药物发展起来的一种改进型药物,它是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。如再生元的Eylea(阿柏西普),是由人体血管内皮细胞生长因子(VEFG)受体12的胞外区与人体免疫球蛋白G1的可结晶片段融合而成的重组融合蛋白,用于治疗眼科疾病等。

5、抗体片段

抗体片段药物也是基于传统单抗药物发展起来的一种改进型药物。抗体片段可以由完整的抗体经不同蛋白酶切割后得到,也可以通过基因工程得到。典型的抗体片段有如下几种:F(ab’)2FabFab’Fv rIgGFc

F(ab’)2FabFab’Fv 是可以从 IgG IgM 的可变区产生的抗原结合片段。这些抗原结合片段的分子量(MW)、化合价和 Fc 含量不同。Fc 片段完全由免疫球蛋白的重链恒定区产生。这些片段和其他一些独特片段结构可以从五聚体 IgM 产生,包括’IgG’型片段、反向’IgG’型片段和五聚体 Fc 片段。

 

三、抗体纯化工艺流程

抗体分离纯化的主要目的是将抗体与工艺相关杂质和产品相关杂质分离,且将潜在内源病毒样颗粒和外源病毒进行灭活去除,最终获得高纯度、低潜在危害的抗体药物。工艺相关杂质包括培养基成分、培养过程中的添加物、细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸及纯化过程中引入的其他杂质等;产品相关杂质包括抗体蛋白降解片段、聚集体、异构体等;潜在病毒主要是宿主细胞自身的内源性病毒样颗粒及工艺过程中可能引入的外源病毒。抗体纯化过程中,一般采用三步纯化策略(图7

捕获(粗纯):分离、浓缩、稳定目标蛋白。产品被浓缩转移到一个可以维持其效能、活性的环境,最好可以去除其他关键杂质。

中间产品纯化:去除大部分性质相似的杂质,例如其他蛋白质和核酸、内毒素和病毒。

:去除一些微量的和分子量相近的杂质和多聚体。


、单抗纯化注意事项

单抗纯化方法的选择,既要考虑单抗基本特性因素,同时又要考虑单抗生产体系特性因素,综合分析选择单抗纯化的工艺。

每个单抗,其分子量、等电点、疏水性、糖基化、pH值稳定性、溶解度、多聚体复合物的形成等生化性质各不相同。单抗纯化方法的选择,要基于上述单抗生化性质因素选择制定纯化工艺。

单抗溶解度生化性质因素:有些单抗在温度低于37℃时溶解度会降低,易结晶,在纯化工艺选择时,应避免冷室操作。

单抗pH值稳定性生化性质因素:一般情况下单抗,在水溶液或一般的缓冲液中都比较稳定,但应避免极端的pH值,如低的pH值会促使蛋白聚集,过高的pH值会促使脱酰胺酶降解单抗,在纯化工艺选择时,应根据单抗pH值稳定性因素选择纯化工艺,避免极端的PH值溶液。

单抗等电点生化性质因素:大多数单抗等电点高于一般血清蛋白,使用阳离子交换层析捕获浓缩抗体或使用阴离子交换层析可除去大部分杂质蛋白、核酸和内毒素;对于CHO细胞表达的基因工程抗体,由于细胞培养过程带来的糖基化的不均一以及后期其他的翻译后修饰等作用,存在的等电点不同的多抗体变体,可用离子交换层析根据带电性质的不同有效除去这些变体,使产品质量更均一。

单抗的疏水性生化性质因素:大多数单抗疏水性较强,可以在0.5~1.0 M硫酸铵存在条件下结合疏水介质,让大部分杂质蛋白流穿;可以先在30%~50%硫酸铵时盐析,重溶后直接进行疏水层析纯化;不同抗体疏水性程度也不同,可以依据具体抗体的疏水性选择合适的填料和缓冲液体系。

单抗的其他生化性质因素:基于单抗基本特性选择纯化工艺除以上单抗的溶解度因素、pH值稳定性因素、等电点因素、疏水性因素外,单抗的分子量、糖基化、多聚体复合物的形成等生化性质也应加以考虑。

基于单抗生产宿主因素选择纯化工艺:可供选择的单抗生产宿主包括直接免疫动物如鼠/兔、杂交瘤细胞、哺乳动物细胞、酵母、转基因动 物、转基因植物等。单抗生产宿主不同,则单抗生产产生的主要相关杂质也不同,纯化清除工艺的也不相同。例如,以酵母作为单抗生产宿主产生的抗体:对以酵母作为单抗生产宿主,单抗生产的主要杂质为宿主细胞蛋白及培养基中蛋白,针对这类杂质,采用中空纤维膜做样品的澄清,之后用离子交换结合疏水层析工艺进行纯化效果比较好。以转基因植物作为单抗生产宿主产生的抗体:对于以转基因植物作为单抗生产宿主,单抗生产的主要杂质为色素、植物细胞杂质蛋白,针对这类杂质,采用亲和层析纯化植物表达抗体效果比较好,对于少量吸附在亲和胶体上的色素,可用分子筛去除。

以杂交细胞瘤作为单抗生产宿主产生的抗体:以杂交细胞瘤作为单抗生产宿主产生的抗体,其主要相关杂质为培养基内的杂质蛋白、转铁蛋白、酶、小牛IgG、酯类以及宿主蛋白和核酸,这类单抗用于诊断试剂和治疗性单抗。其中治疗性单抗纯度要求较高(95%~99%),需要多步骤、多维层析去除宿主杂质。其中转铁蛋白、小牛IgG与目标抗体性质接近,污染问题十分显著,一般可通过优化疏水层析和离子交换层析去除;若白蛋白的量较多,可先用蛋白A蛋白G等亲和层析法直接捕获抗体。

作为单抗生产宿主,除以上以酵母作为单抗生产宿主、以转基因植物作为单抗生产宿因素、以杂交细胞瘤作为单抗生产宿因素外,还有其他单抗宿主如:直接免疫动物如鼠/兔、哺乳动物细胞、转基因动物等,选择纯化工艺时,应结合宿主优缺点及主要相关杂质特性等选择纯化策略。

总之,单抗纯化工艺的选择,既要考虑单抗体基本生化性质因素,同时又要考虑单抗生产宿主的特性因素,综合分析选择单抗纯化的工艺。

 

五、纽龙产品介绍

金沙990活动大厅-www.990.com是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的国家高新技术企业。基于自有技术平台,实现填料与配的双重突破,开发出一系列可用于不同抗体的纯化填料,如Protein AProtein GProtein L、耐碱Protein A等,性能可比可靠,批间差小供货持续稳定,可以满足客户在抗体纯化领域的不同需求,如有需要,欢迎拨打0571-82872376联系。

参考文献:

[1]  A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impuritiesYifeng Li/doi.org/10.1016/j.pep.2018.11.01

[2]  Tiller KE, Tessier PM. Advances in Antibody Design. Annu Rev Biomed Eng. 2015;17:191-216. doi: 10.1146/annurev-bioeng-071114-040733. Epub 2015 Aug 14. PMID: 26274600; PMCID: PMC5289076.

[3]  Hober S, Nord K, Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Mar 15;848(1):40-7. doi: 10.1016/j.jchromb.2006.09.030. Epub 2006 Oct 9. PMID: 17030158.

[4] 医药笔记:2021年FDA批准的8款抗体新药


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