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生物素-链霉亲和素信号放大系统的运用

发布日期:2023-09-22 阅读次数:597

生物素-亲和素简介

生物素是一种水溶性维生素,也被称为维生素B7、维生素H或辅酶R,广泛分布于动、植物组织中,主要从含量较高的卵黄和肝组织中提取,分子量244.31Da。生物素分子有两个环状结构(图1),咪唑酮环和噻吩环,经化学修饰后,生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。活化生物素可以在交联剂的介导下,与已知的几乎所有生物大分子偶联,包括蛋白质,核酸,多糖,脂类等。

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1 生物素化学结构图

亲和素avidin亦称抗生物素蛋白、卵白素(图2),是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白1个亚基能结合1个生物素,1摩尔亲和素能结合4摩尔生物素,二者亲和常数(K高达10-15mol/L是目前已知的除共价结合以外、最强的非共价相互作用之一,基于此,生物素-亲和素系统可用于多层次信号放大场景。

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2 亲和素结构示意图

链霉亲和素(streptavidin,简称SA)分子量约53kDa,是由链霉菌Streptomyces avidin在培养过程中分泌的一种蛋白质,由4条相同的肽链组成,每条肽链都能结合一个生物素。链霉亲和素等电点比亲和素低,不含糖链,具有更少的非特异性吸附,且具有更高灵敏度,所以链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。链霉亲和素和亲和素的差异可见下表(表1)。


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1 链霉亲和素和亲和素的差异

 

生物素-链霉亲和素信号放大系统

生物素和链霉亲和素可以与大分子物质(例如抗体)广泛结合,而不会对其功能(如抗体的抗原识别位点)产生影响。因此,生物素-链霉亲和素系统得到了广泛的运用。通过对特定物质的修饰,可以提高检测系统的灵敏度。生物素和链霉亲和素通过与酶、放射性核素及荧光素等各类标记技术结合,可以用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及原位观察研究,也可用于亲和纯化工艺,用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。如体外诊断行业中的化学发光检测项目(CLIA),光激化学发光(LICA),酶联免疫吸附检测(ELISA)等等。

 

1ELISA(酶联免疫吸附)中的应用

ELISA旨在检测针对细菌或病毒的抗原或抗体,具体操作步骤如图3BAS(Biotin-Avidin System)-ELISA在常规ELISA原理的基础上,把BASELISA结合起来,利用生物素与链霉亲和素间的高度放大作用而建立的一种检测系统(图4。用小分子生物素标记抗体可减少反应中的空间位阻,结合了酶的链霉亲和素分子与结合了特异性抗体的生物素分子产生反应,起到了多级放大作用酶在遇到相应底物时,发挥催化作用而使底物显色,达到检测待检物分子的目的,大大提高了ELISA测定的灵敏度。

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3  ELISA双抗夹心法原理

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4  BAS-ELISA信号放大系统

 

2、在CLIA(化学发光)中的作用

化学发光免疫分析结合了免疫检测和酶促发光技术,是一种先进的免疫检测方法,基于BAS系统的化学发光免疫分析因高灵敏度、高稳定性、检测准确等优势被广泛应用。其中,吖啶酯化学发光分析是目前市场比较好的免疫分析方法。吖啶酯化学发光、链霉亲和素-生物素放大体系(图5)主要由吖啶酯标记的抗体或抗原、生物素标记的抗体或抗原、链霉亲和素包被官能团的磁珠几部分构成,由于生物素和链霉亲和素是以4:1的比例相结合,吖啶酯-生物素-抗原抗体复合物也是以4倍的比例与链霉亲和素结合,这样发光信号也扩大了4倍,检测灵敏度更高。目前迈克生物、亚辉龙生物等都采用了类似的反应原理。

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5 吖啶酯反应原理(夹心法一步法为例)

 

3、在亲和纯化中的运用——Strep-tag纯化系统

基于链霉亲和素和生物素之间强烈的相互作用,科学家运用一系列蛋白质工程手段,从短肽文库中筛选获取链霉亲和素可逆性结合的短肽亲和标签(图6,同时也对链霉亲和素的蛋白序列进行改进,双管齐下,历经三代改造,Strep-tag纯化系统脱颖而出,现已成为被广泛应用的亲和纯化系统之一。

Strep-tag纯化系统的突出特点是:纯化过程温和,保证了蛋白的生物活性和空间结构;特异性好,一步纯化后得到高纯度目的蛋白(>95%);能兼容多种表达系统,包括原核、酵母、昆虫、植物细胞哺乳动物细胞等;还能替代金属离子螯和层析方法,避免金属离子对蛋白的干扰。

 

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6 目前两种广泛使用的Strep标签

 

4、在激化学发光(LICA)中的运用

光激化学发光(Light Initiated Chemiluminescent Assay)(图7)是一种均相免疫检测技术;基于FRET (fluorescence resonance energy transfer) ,感光珠接受激发光产生单线态氧,单线态氧把能量传递至距离感光珠200nm范围内的发光珠,最终产生光信号SA信号放大系统使光信号得到进一步增强。

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7 光激化学发光示意图

 

5、在胶体金法检测试剂盒中的运用

胶体金法检测试剂盒的基本原理是抗原抗体特异性反应,当机体免疫系统识别出病毒抗原后产生抗体,抗体进一步与病毒抗原发生特异性结合,这种特异性结合在体外也能发生,于是诞生了检测试剂盒,如:抗原检测试剂盒,胶体金免疫层析结构如图8

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8 胶体金免疫层析结构

 

6、在IFA(荧光免疫技术)中的作用

BAS 用于荧光抗体技术通常用荧光素直接标记链霉亲和素(BA 法)来连接生物素化抗体;也可采用游离链霉亲和素搭桥两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素(BAB)或荧光标记抗链霉亲和素抗体的夹心法。

 

7、在其它方面的运用

生物素-链霉亲和素在分子生物学中的运用日益增多,目前主要集中在三个方面:用BAS 制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化;以生物素标记核酸探针进行定位检测;将免疫测定技术与PCR 结合建立免疫-PCR(immun-PCR)用于抗原的检测。

此外,SA系统可以辅助发现蛋白作用机理,在生物传感器领域也有广泛的运用,能够对分子相互作用的动态过程进行实时监控,SA系统用于研究生物信号的放大作用。

 

关于纽龙:

金沙990活动大厅-www.990.com是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产、销售国家高新技术企业。基于野生型链霉亲和素序列,通过序列设计、蛋白重构,自主研究开发出一系列不同特性的链霉亲和素产品,通过调整链霉亲和素的氨基酸序列、末端氨基酸组成、生物素结合域,可以满足客户在化学发光、ELISA、胶体金、SA磁珠制备、Strep-tag标签蛋白纯化等领域的应用,如有需要,欢迎拨打0571-82872376联系我们。

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参考文献:

[1]张靖等. "高灵敏电化学发光法特异性测定人血清抗甲状腺球蛋白抗体." 标记免疫分析与临床 (2021).

2]俞文杰. 光纤生物传感器表面功能化及链霉亲和素探测研究[D].中国计量学院,2016.

[3]Erdmann, K. S. et al. The Adenomatous Polyposis Coli-protein (APC) interacts with the protein tyrosine phosphatase PTP-BL via an alternatively spliced PDZ domain. Oncogene 19, 3894-3901 (2000).

[4]Dundas CM, Demonte D, Park S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2013 Nov;97(21):9343-53. doi: 10.1007/s00253-013-5232-z. Epub 2013 Sep 22. PMID: 24057405.

[5]Stayton PS, Freitag S, Klumb LA, Chilkoti A, Chu V, Penzotti JE, To R, Hyre D, Le Trong I, Lybrand TP, Stenkamp RE. Streptavidin-biotin binding energetics. Biomol Eng. 1999 Dec 31;16(1-4):39-44. doi: 10.1016/s1050-3862(99)00042-x. PMID: 10796983.


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