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制药工具|蛋白纯化常见标签

发布日期:2023-11-15 阅读次数:474

重组蛋白是应用基因重组克隆技术从而获得的蛋白质。基因重组技术先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因,再连接到适合的表达载体,导入到特定的宿主细胞,利用宿主细胞的遗传系统,最终表达出具有特定功能的蛋白质。

重组蛋白表达技术已经广泛应用于生物学的各个领域,目前,体外重组蛋白表达系统主要有以下几类:原核表达系统、真核表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统。一般的实验过程包括载体构建-表达鉴定-蛋白纯化等等。

其中,蛋白纯化的目的是将目标蛋白从实验样本中分离出来,同时仍保留目的蛋白的理化特性及生物学功能。在蛋白纯化的过程中,合适的标签不但有利于蛋白的纯化,同时也可能对蛋白的可溶性和稳定性有一定帮助。利用基因重组技术,将蛋白标签与目的蛋白一起融合表达并用于下一步纯化。目前较为常用的蛋白标签主要有:His-tag、GST-tag、MBP-tag、Strep-tag II、SUMO-tag、HA-tag等,部分功能和特点如下表所示。

标签蛋白特点.png

一、His-tag

His-tag由多个组氨酸残基(一般为6个)组成,可插入在目的蛋白的C末端或N末端,标签本身的特性对目的蛋白影响很小,免疫原性相对较低,纯化的蛋白直接用于抗体制备,是目前最常用的表达纯化标签。

His-tag可以Ni2+、Co2+过渡金属离子形成配位键,与金属离子选择性结合,从而可以将金属离子固定在磁珠或树脂上,对蛋白进行纯化。其中,Ni2+是亲和纯化实验中使用最多金属离子Ni2+在琼脂糖上的螯合形式多样,不同的螯合结构决定了Ni2+在层析介质上的稳定性和结合能力差异,目前市面上His-tag蛋白纯化介质比较常用的配基是IDA、NTA和TED

NI.png

使用方法简述:

1、平衡和上样:用平衡缓冲液平衡层析柱,进行上样。

2、洗杂:在缓冲液中添加低浓度的咪唑(譬如5~50mM冲洗层析柱。

3、洗脱:用合适浓度的咪唑缓冲液进行洗脱(建议用50~500mM的线性梯度)。

4、再生:建议选择加有200 mM EDTA+500 mM NaCl的缓冲液将Ni2+金属离子剥离

5、在位清洗(CIP):通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。

6、填料保存:填料的初始保存液为20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃为宜,不可冻存。


二、GST-tag

1988年,SmithJohnson首次提出谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和标签的概念,GST是由多基因编码、具有多种功能的超家族酶,广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内,其专一性催化还原型的谷胱甘肽巯基与其他化合物的亲电基团,生成谷胱甘肽衍生物。在生物研究领域,来源于日本血吸虫的GST,是目前应用最为广泛的融合标签之一。基于酶和底物的作用原理,利用谷胱甘肽(GSH)结构和GST结合位点互补的特点,将谷胱甘肽SH基团与琼脂糖介质上的预活化基团偶联,形成特异性的亲和填料。带有GST标签的目标蛋白与琼脂糖介质上交联的GSH配基发生结合。这种结合具有可逆性,可以在温和、非变性的条件下通过在缓冲液中加入还原型GSH洗脱下来,杂质在结合过程中流穿或被洗脱去除,实现目的蛋白的分离。

GST-tag作为标签蛋白应用到重组蛋白的纯化过程中,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。一般选择GST-tag可以提高蛋白表达的可溶性,也可以一定程度上提高蛋白的表达量。蛋白表达纯化结束后需根据不同的下游应用而确定是否切除标签。GST-tag洗脱条件温和,但跟His-tag相比,分子量较大,可能会影响蛋白的功能和下游实验的应用。另外,如果蛋白以不可溶的方式表达出来,很难用变性复性的方法进行纯化。

使用方法简述:

1、平衡和上样:用平衡缓冲液平衡层析柱,进行上样。

2、洗脱:用合适浓度(建议10 mM)的还原型谷胱甘肽溶液进行洗脱。

3、再生:先用蒸馏水冲洗,接着用平衡液冲洗至平衡。

4、在位清洗(CIP):可用盐酸胍也可用70%乙醇清洗。

5、填料保存:填料的初始保存液为20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃为宜,不可冻存。


三、MBP-tag

MBP即麦芽糖结合蛋白,由大肠杆菌K12malE基因编码,是细菌麦芽糖转运系统的成员之一,能结合微摩尔水平的麦芽糖和麦芽糊精。1988年,MBP亲和标签首次应用于大肠杆菌重组蛋白的表达纯化,值得一提的是,MBP的折叠过程需要DnaK-DnaJ-GrpEGroEL-GeoES两个分子伴侣系统的帮助,当进行MBP融合蛋白的重组表达时,这些分子伴侣也会聚集在目标蛋白的附近,帮助它们正确折叠,并增加目标蛋白的可溶性。

MBP是蛋白质纯化最常用的大标签,分子量约42 kDMBP可以和糊精亲和树脂结合,可用10-20 mM麦芽糖在温和条件下洗脱,得到高纯度、高浓度目标蛋白,达到快速、高效的捕获与纯化目的。若需要除去MBP-tag可用位点特异性蛋白酶切除。

使用方法简述:

1、平衡和上样:用平衡缓冲液平衡层析柱,进行上样。

2、洗脱:一般推荐用10mM麦芽糖溶液进行洗脱。

3、再生:先用蒸馏水清洗,然后用0.5M NaOH再生。

4、填料保存:填料的初始保存液为20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在4~30 为宜,不可冻存。


四、Strep-tag II

Strep-tag基于生物素和链霉亲和素之间的相互作用而开发出来的。Strep-tag分子量较小,仅有0.8kD融合后蛋白质结构和功能的影响可以忽略不计,通常无需切除。早期开发的第一代Strep-tag仅可以接在蛋白的C端,对实际应用产生了一定的限制,故而研究者在Strep-tag的基础上,进一步开发了Strep-tag II,可以结合在蛋白质的N端和C端。不过随着对标签的特异性以及亲和力的要求进一步提升,研究者进一步进行了改造,通过将两个Strep-taglinker连接在一起,开发出Twin Strep-tag,再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin结合强度,改善了低浓度样本纯化效果,还能于捕捉蛋白复合体、检测蛋白间的相互作用。Strep-tag 具有特异性高、单步纯化纯度高、过程条件温和、蛋白两端均可融合等特点。

同时相应地,作为纯化配基的链霉亲和素,为了增强和标签的亲和能力,以及降低洗脱的难度,研究者也进行了一系列的改造。纽龙生物研发团队通过分子克隆蛋白重组等技术,对链霉亲和素进行改造,开发出Strep-tactinStrep-tactin2做为纯化填料的配基,具有更高的亲和力,可以按照不同应用场景选用不同的物质进行洗脱和再生,满足不同的需求。

使用方法简述:

1、平衡和上样:用平衡缓冲液平衡层析柱,进行上样。

2、洗脱:用合适浓度的缓冲液(脱硫生物素或生物素)进行洗脱。

3、再生:用0.5M NaOH或者合适浓度的HABA缓冲液再生。

4、填料保存:填料的初始保存液为20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在4~30 为宜,不可冻存。

随着研究需求的增多和生物技术的发展,各种标签应运而生,多样化的标签蛋白可以满足不同的实验目的,除了本文提到的标签外,还有Myc、HA、SUMO等,如您有新的标签蛋白以及纯化填料需求,纽龙生物愿以开放的态度,与您携手,共同开发。 


五、纽龙产品介绍

金沙990活动大厅-www.990.com是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的国家高新技术企业。基于自有技术平台,实现填料与配基的双重突破,开发出一系列可用于不同标签蛋白的纯化填料,如Ni-IDA NUPharose FFGST NUPharose FFStrep-Tactin NUPharose FFDextrin NUPharose FF等,性能可比可靠,批间差小,供货持续稳定,此外,我们提供不螯合金属离子的纯化填料,可以满足客户在重组蛋白纯化领域的不同需求,如有需要,欢迎拨打0571-82872376联系我们。


参考文献:

[1]Pina, Ana & Batalha, Íris & Roque, Ana. (2014). Affinity Tags in Protein Purification and Peptide Enrichment: An Overview. 10.1007/978-1-62703-977-2_14.

[2]Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013 Sep 24;73:9.9.1-9.9.23. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73. PMID: 24510596; PMCID: PMC4527311.

[3]Mishra V. Affinity Tags for Protein Purification. Curr Protein Pept Sci. 2020;21(8):821-830. doi: 10.2174/1389203721666200606220109. PMID: 32504500.









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