3 、使用方法参考

3.1  色谱柱装填

NuPore  填料的装柱方法与琼脂糖凝胶微球一致，避免了葡聚糖分子筛填料装柱前 需要溶胀的过程。以下阐述与层析系统连接时，NuPore 填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算： 通过沉降定量填料体积， 需要的沉降填料体积=柱体积× 1.15~1.20（即压缩比约为 1.15~1.20）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降

24 h 以上读取的稳定体积。冻干粉需溶胀完全后使用。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将清洗好的填料转移到适当的容器中，加入填料体积的三 分之一到一倍的纯化水制成 50~75%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入蒸馏水，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或低于 50 cm/h 的流速下沉降），待填料沉降完 全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面上约 0.5 cm 的位置；通过 150 cm/h 的流速（注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清 晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵 头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

3.3  上样

（1）缓冲液选择：一般选用 pH=6~8 的缓冲液，常用缓冲液有 20-150 mmol/L 的磷 酸钠缓冲液、20~200 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液等。可在缓冲液中加入 0.15~0.5 mol/L 的 NaCl，以消除非特异性吸附作用。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选分离缓冲液一致。样品上柱前应 0.45 μm 过 滤。

（3）上样量：用于组族分离，上样量可达柱体积的 20~30%；用于组分分离，上样 量推荐为柱体积的 0.5~4%，样品浓缩后上样可增加处理量。

3.4  分离

（1）使用平衡缓冲液冲洗层析柱，通过 UV、示差等信号监测流出组分的信息。组 族分离时，一般 1.0 CV 以内可获得目标产物；分级分离时，需要 1.5 CV 收集所有的产 物组分。

3.5  再生与平衡

（1）在第二次上样前，需要对色谱柱进行再生与再平衡。再生过程一般使用平衡缓 冲液冲洗层析柱 2~3 CV ，当流出液的电导、pH 等信号与平衡缓冲液基本一致，即可进 行第二次上样。

3.6  在位清洗

使用完的层析柱出现堵塞、压力增大、流速减慢、载量下降等情况时， 就需要进行 在位清洗。通常情况下，推荐使用 5 次后进行在位清洗。NuPore 在位清洗最常用的方 法：使用完的层析柱用蒸馏水清洗 3~5 个柱体积，然后用 0.5~1 mol/L 的 NaOH 溶液， 清洗 3~5 个柱体积（保持时间 0.5~1h），然后用蒸馏水清洗至中性即可。同其它层析介 质一样，为了达到更好的清洗目的，可以采用反向清洗；如需去除热源，可在 1 M NaOH中保持更长时间（2h 以上）。