1 、产品介绍
NHS Activated NUPharose FF 预活化填料是在琼脂糖凝胶微球骨架表面修饰十个原 子长度的间隔臂后,再用 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基形成的预活化分离介质。 NuPerley NHS HR 则是基于新一代高刚性琼脂糖 NuPerley 技术平台的预活化填料,分辨 率更高。NHS 活化基团可与抗体、蛋白、酶、多肽等含伯胺的功能性生物大分子偶联形 成稳定的酰胺键,得到的亲和层析分离介质可特异性结合目标分子,一步纯化即可获得 高纯度产物,因而 NHS 预活化填料广泛应用于科研和生产领域。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | NHS Activated NUPharose FF | NuPerley NHS HR |
目录编号 | NRPB11L ,NRPB11S(预装柱) | NRPB90L ,NRPB90S(预装柱) |
基质 | 4%交联琼脂糖 | 高分辨高刚性琼脂糖 |
粒径范围 a | 45~165 μm | 20~50 μm |
平均粒径 | ~90 μm | ~35 μm |
活化配基 | NHS,>10 μmol/mL | |
推荐工作流速 | 60~300 cm/h | |
最大流速与压力 b | >900 cm/h ,0.3 MPa | |
使用 pH | 6~9(偶联缓冲液) | |
储存与运输 | 100%异丙醇,-25~-10 ℃(存储),2~8 ℃(运输) | |
保质期 | 1 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围; b 10 cm 柱高下的最大测试流速。
3 、使用方法参考
NHS 预活化填料的保存液为 100%的异丙醇,在使用前需要将保存液去除。为保持 NHS 预活化填料的偶联能力,需预先准备好经 0~4 ℃预冷的置换溶液与反应液,且各步 骤之间尽可能少停留。以下为将配基偶联至 NHS 预活化填料的一般步骤。
步骤 | 操作 |
1 | 与填料等体积的溶液定义为 1 CV,分多次用 5~15 CV 浓度为 1 mM 的 盐酸清洗填料,以除去保存液。盐酸溶液需预冷,除去保存液后需立即 用于偶联。 |
2 | 在完成步骤 1 时,需准备好偶联缓冲液以及溶有偶联配基的偶联液。偶 联液的 pH 通常在 6~9,例如 0.2 M NaHCO3 + 0.5 M NaCl ,pH 8.3。填 料与偶联液的体积比在 1 :1~1:0.5,若即填料体积占比太小,将不利于 偶联率的提高。 |
3 | 将偶联液与处理好的填料混合,可将体系 pH 调节至预定值。通常在室 温条件下偶联过程需要 2~4 小时,在 4 ℃条件下偶联过程需要过夜。 |
4 | 偶联完成后需要对未反应的 NHS 基团进行封闭,封闭液可以选 pH 8.5 左右浓度为 0.5 M 的乙醇胺或者 0.1 Tris-HCl,室温条件下 2 小时可将 NHS 基团封闭完全。也可以在弱碱性的条件下检测有无 NHS 残留,NHS 在 280 nm 处有较强的紫外吸收值。 |
5 | 可用弱碱(例如 pH 8~9 浓度为 0.1 M 的 Tris-HCl 缓冲液)和弱酸(例如 pH4~5 浓度为 0.1 M 的醋酸钠缓冲液,含 0.5 M 氯化钠)缓冲液交替清 洗 3~5 次,每次使用 3 CV。偶联完成的填料保存在 20%乙醇中,以免长 菌。 |
4、应用实例参考
实验名称:NHS NUPharose FF 偶联 IgG。
步骤 1:配制抗体偶联液。取 100 mg IgG,加入 10 mL 偶联缓冲液(0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl ,pH 8.3)溶解,留 0.1 ml 以测定偶联率。
步骤 2 :偶联反应。取 10 ml NHS NUPharoseFF ,用预冷的 50 ml 1 mM 盐酸分三次 清洗去除保存液。清洗后立即与抗体偶联溶液混合,在 4 ℃条件下震荡过夜,进行偶联 反应。
步骤 3:封闭。滤出反应液, 用 50 ml 偶联缓冲液清洗偶联后的凝胶,然后用 10 ml 封闭缓冲液(0.2 M NaHCO3, 0.5 MNaCl, 0.5M 乙醇胺, pH8.3),在室温条件下震荡 4 小 时以封闭未偶联的基团,封闭后用 50 ml 蒸馏水分多次将微球清洗干净。
步骤 4:检测。偶联前后的反应液用 SDS-PAGE 检测,计算偶联效率,偶联好的填 料根据配基特性测定功能。无法通过测定偶联后反应液在 280 nm 波长下的吸光度来计 算偶联率,因为 NHS 基团在 280 nm 的吸收强。
注意事项
1、如果配基的稳定性不了解,可以选择不同 pH 的缓冲液和温度,不加填料模拟偶 联条件,观察溶液是否会产生沉淀。沉淀将影响偶联效果,可以降低 pH 或温度,同时 可以加 5%左右的甘油或 PEG 保护蛋白,避免产生沉淀。
2、偶联的缓冲液可以是碳酸盐、硼酸盐和磷酸盐缓冲液,不能使用氨基的缓冲体 系,如 Tris-HCl 缓冲液。
3、封闭的缓冲液一般使用带氨基的小分子试剂,如乙醇胺、Tris 等,在 pH 8~9、 室温条件下数小时可封闭完全。
4、在偶联中尽量使用温和的混匀方式,如震荡、翻转、旋转等。如使用机械搅拌, 需要降低搅拌的速度,只要把填料能混匀完全悬浮起来即可,避免剧烈搅拌使凝胶微球 破碎或使蛋白变性。不可使用磁力搅拌。
5 、产品规格与订购信息
基于强大的研发实力和丰富的数据积累,除了下述标准型号的填料,纽龙生物接受 定制非标准型填料产品。纽龙生物竭力在最短时间内交付客户, 为客户提供最佳的产品 与服务。