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制药工具|内毒素来源及检测方法

发布日期:2023-12-08 阅读次数:728

一、内毒素简介

大肠杆菌是生物领域最常用的工程菌之一,具有生长速度快、培养成本低、基因克隆表达系统成熟完善等优势,其质粒常被用作基因工程中的载体,在基因的分子克隆、疫苗研发、重组蛋白类药物的表达和生产等领域已有广泛的应用,但同时需要严格控制相关生物制品中内毒素的残留水平。

内毒素位于革兰氏阴性菌细胞壁的最外层,覆盖于细胞壁的黏肽上,化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物,主要毒性成分是脂多糖(LPS)中的类脂A(图1),只有当菌体死亡溶解或者用人工方法破坏菌体细胞后内毒素才释放出来。内毒素能够直接作用于人体,通过与宿主细胞上的Toll样受体(TLR)结合激活组织内的炎性细胞及炎症因子,导致机体发热并产生全身炎症性反应,继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状,又称之为热原。内毒素具有极强的生物活性,即使是微量内毒素也会引起机体的各种炎症反应和免疫应答。内毒素具有较好的耐热性和稳定性,在60℃的温度下加热数小时也不会被破坏,完全灭活需在180℃高温下加热3小时以上,一般的化学药品也不会影响细菌内毒素的活性,只有强酸、强碱或强氧化剂可以破坏其结构。

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二、内毒素的检测方法

内毒素可以与特定的检测试剂发生反应,基于这一原理开发出内毒素的检测方法。常见的检测方法包括凝胶法、重组C因子法、动态比浊法等。

鲎试剂中的C因子是对内毒素敏感的蛋白,能够与内毒素结合并被激活,从而启动整个鲎试剂血凝级联反应(图2),凝胶法根据该原理来检测内毒素,并通过观察有无凝集素形成作为反应的终点。该方法简便易操作且不需要使用光学检测仪,但检测范围存在一定的局限性。

鲎试剂的制备需要捕捉大量的鲎并抽取其血液(图3),随着对鲎的保护以及重组技术的发展,新一代人工合成的重组C因子开始被用于内毒素的检测中。重组C因子被内毒素活化后能够与荧光底物作用产生荧光信号,荧光信号强度与内毒素浓度成正比关系,可据此来测定内毒素含量。该检测方法不存在G因子旁路干扰,具有较高的特异性,可用于含有β-葡萄糖干扰的样品检测。

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动态比浊法可通过光学测定仪测定反应混合物达到预定OD值所需时间和浊度变化的速率,检测数据不仅有利于追踪产品质量,还能起到风险预警作用。


三、内毒素的去除方法

由于内毒素具有显著的危害性,FDA等法规也对内毒素控制提出明确要求。首先要从源头消除外源性内毒素污染,在生物药物研发及生产过程中,要确保与样品直接接触的设备、容器、储液袋、原辅料、耗材等经过严格消毒灭菌处理。其次对于样品本身就存在的内源性内毒素污染,需要从样品本身制备工艺角度出发,寻找合适方法,如离子交换层析法、疏水层析法、特异性吸附等。

离子交换层析法:根据目标产物与内毒素在缓冲液中的带电性质差异,可以利用离子交换层析的方法去除内毒素。阴离子交换层析主要通过改变缓冲液的离子强度使内毒素分子带大量负电荷,能够与带正电荷的配基结合,从而将其去除;阳离子交换层析主要采用吸附模式,通过改变缓冲液的pH使带正电荷的目的蛋白吸附在离子交换介质上,带负电荷的内毒素流穿,实现分离。

疏水层析法:内毒素在高盐条件下会聚集成大多数不与疏水填料结合的复合物,上样时直接穿透而被去除。或者采取目标样品流穿模式,在一定盐浓度下使目的蛋白不与填料结合而内毒素分子可与其结合,从而实现分离。

特异性吸附:将多粘菌素B偶联于层析介质上,通过介质特异性吸附内毒素,蛋白因不会被该层析介质吸附而随流动相流出,收集该流出蛋白即可。该方法去除内毒素效果较好, 但有一定的蛋白损失。

此外,还可以依据内毒素在不同的水溶液中形成的聚集体分子量大小差异,通过凝胶过滤层析和切向流膜过滤技术等方法将其去除。

 

四、关于纽龙

大肠杆菌因培养成本低且基因克隆表达系统成熟完善等优势成为蛋白表达系统中常用的工程菌,但其自身存在的内源性内毒素残留是不可避免的问题。在产品开发过程中,内毒素的残留控制和检测是重要的环节之一。

纽龙生物科技有限公司是一家专注于重组蛋白以及蛋白纯化填料研发生产的国家高新技术企业,致力于提供最专业的制药工具与服务,产品自立项开发之初便重点关注内毒素的残留控制及检测。近日,依据《全国城市工业品贸易中心联合会团体标准管理办法》有关规定,纽龙生物全资子公司纽龙合成材料制造有限公司作为牵头单位,积极参与推动《生物分离介质内毒素检测方法》团体标准的制定工作。

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参考文献:

[1] Chen R H, Huang C J, Newton B S, et al. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion exchange chromatography[J]. Protein Expression & Purification, 2009, 64(1):76-81.

[2] 徐向荣,马国昌,王昌梅,等.层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素[J]. 生物工程学报, 2008(01): 159-163.

[3] Rita F Maldonado, et al., Lipopolysaccharide modification in Gram-negative bacteria during chronic infection. FEMS Microbiol Rev. 2016 Jul;40(4):480-93.doi: 10.1093/femsre/fuw007.



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