3 、使用方法参考

3.1  色谱柱装填

NUPhadex G-25 分子筛填料的装柱方法与琼脂糖凝胶微球类似，产品如果是干粉的 形式，则需要预先溶胀后再装填（从下述步骤 1  开始），产品如果是溶胀后分散液的形 式，则可直接装柱（从下述步骤 2 开始），避免了需要预先溶胀的过程。以下阐述与层 析系统连接时，NUPhadex G-25 填料的色谱柱装填方法。

（1）溶胀

产品如果是干粉的形式，按~5 mL 缓冲液（或者水）/g 干粉的比例溶胀微球，在常 温下通常需要 3 h，升高温度则可以缩短溶胀时间。需避免使用粘度过大的缓冲液，液 体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算

通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩系数。沉降体积是指 填料在 20%乙醇保存液中自然沉降 24 h 以上读取的稳定体积，压缩系数在 1.10~1.20 之 间，该系数跟微球粒径和层析柱尺寸相关。最小粒径的 SF 级的压缩系数为~1.20，M 级 为~1.15 ，C 级为~1.10。

（3）装柱填料悬液准备

将清洗好的填料转移到适当的容器中，加入填料体积的三分之一到一倍的缓冲液或 者水制成 50~75%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（4）装填前准备

在清洗干净的层析柱下端加入蒸馏水，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内 保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（5）装填

将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入 气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧 紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（6）压柱

使柱内填料自然沉降（或低于 50 cm/h 的流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与 液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面上约 0.5 cm 的位置； 不同粒径的微球通过不同的流速（注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置， 旋紧柱头，装柱完成。 下表为不同粒径NUPhadex G-25 的推荐压缩系数和装柱流速。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

3.3  上样

（1）缓冲液选择：一般选用水系缓冲液，根据除盐或者换液后的缓冲体系决定，例 如磷酸钠缓冲液、Tris-HCl 缓冲液等。缓冲液中含 0.05 mol/L 的盐时，即足以消除潜在 的非特异性吸附作用。

（2）样品处理：样品的缓冲液应与所选分离缓冲液一致。样品上柱前应 0.45 μm 过 滤。

（3）上样量：用于组族分离（除盐与换液），上样量可达柱体积的 20~30%。

3.4  分离

使用平衡缓冲液冲洗层析柱，通过 UV 、电导等信号监测流出组分的信息。组族

分离时，一般 1.0 CV 以内可获得目标产物；分级分离时，需要 1.5 CV 收集所有的产物组 分。

3.5  再生与平衡

在第二次上样前，需要对色谱柱进行再生与再平衡。再生过程一般使用平衡缓冲液 冲洗层析柱 2~3 CV ，当流出液的电导、pH 等信号与平衡缓冲液基本一致，即可进行第 二次上样。

3.6  在位清洗

使用完的层析柱出现堵塞、压力增大、流速减慢、载量下降等情况时， 就需要进行 在位清洗。通常情况下， 推荐使用 5 次左右进行在位清洗。NUPhadex G-25 在位清洗最 常用的方法：使用完的层析柱用蒸馏水清洗 3~5 个柱体积，然后用 0.1~0.5mol/L 的 NaOH 溶液，清洗 2~3 个柱体积，然后用蒸馏水清洗至中性即可。同其它层析介质一样，为了 达到更好的清洗目的，可以采用反向清洗。

3.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30℃ 为宜，不可冻存。粉末需在干燥的 2~30 ℃环境中保存。

4 、NUPhadex G-25 分子筛填料预装柱简介

4.1 NUPhadex G-25 SF pre-packed column (Y series)中压预装柱 Y 系列

超细粒的 NUPhadex G-25 SF 级产品设有 5 mL 的中压预装柱（预装柱尺寸为 φ/h: 16 × 23 mm），该预装柱可接层析设备使用，也可以接针筒注射器、蠕动泵使用，适用 于少量样品（0.1~1.5 mL）的换液或除盐，最大使用流速可大于 5 mL/min 。具体使用过 程可参照 3.3~3.7 小节。

4.2 NUPhadex G-25 M pre-packed gravity column 重力预装柱

中粒的 NUPhadex G-25 M 级产品设有 8.5 mL 的重力预装柱（内径 15.8 mm，装填 高度~4.4 cm），该预装柱可以依靠重力自流（graviy flow），也可以装适配器后在相应的 离心机中使用，最大的上样量为 2.5 mL 。依靠重力自流纯化样品的方法阐述如下。

（1）填料保存在 20%乙醇中，去除重力柱的上盖后，可将保存液上清液倒出。

（2）摘下下堵头，将平衡缓冲液加入重力柱中，置换填料微球中的保存液。通常 2~3 体积的缓冲液（2~3CV）可将保存液置换完全。

（3）加入至多2.5 mL 样品于重力柱中，若样品不足 2.5 mL，则待样品自流完全后 补充平衡缓冲液至 2.5 mL。

（4）加入 3.5 mL 平衡缓冲液将目标产物洗脱，并收集。可分管收集洗脱液，并对 洗脱液的电导和 UV 吸收值等参数进行检测。

（5）市面上有些重力预装柱为一次性使用产品，本产品在进行再生、清洗后可重复 使用，可参照 3.5~3.7 小节进行操作。

4.3 NUPhadex G-25 M pre-packed spin column 离心柱

中粒的 NUPhadex G-25 M 级产品还设有 0.6 mL 的离心柱产品，该离心柱可与标准 离心管配套使用，最大上样量为 180 μL 样品，使用方法参考如下。

（1）将离心柱中的填料分散均匀后，用 800 g 左右的离心力离心 30~60 秒以去除保 存液，加入 400 μL 平衡缓冲液以同样的方式离心，并再重复 4 次。舍弃的保存液或者 平衡缓冲液收集在合适的离心管中。

（2）更换收集离心管，在离心柱中缓慢加入至多 180 μL 样品，800 g 左右的离心 力离心 120 秒以收集样品。当样品较少时，例如少于 140 μL，加入样品后可补加平衡缓 冲液至 140 μL。

（3）本产品可作为一次性使用产品，也可以在进行再生、清洗后可重复使用， 可参 照 3.5~3.7 小节进行操作。

4.4 NUPhadex G-25 C pre-packed column (S series)中压预装柱 S 系列

粗粒的 NUPhadex G-25 C 级产品设有 53 mL 的中压预装柱（预装柱尺寸为 φ/h: 26 × 100 mm），该预装柱可接层析设备使用，最大上样量可达 15 mL，最大使用流速可达 30 mL/min。具体使用过程可参照 3.3~3.7 小节。