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NRPB131、NRPB132 & NRPB133——NUPhadex G-25 SF、NUPhadex G-25 M和NUPhadex G-25 C分子筛填料

发布日期:2018-10-27 阅读次数:955

1 、产品介绍

NUPhadex G-25 系列分子筛填料是环氧氯丙烷交联的右旋糖苷微球。右旋糖苷对生 物分子的非特异性吸附极低,亲水、多孔的交联右旋糖苷微球主要用于生物分子的快速 换液、除盐等组分离过程,具备样品稀释程度小,除盐率和回收率高的特点。本产品对 球蛋白的排阻极限在 5000 Da 左右,分子量相对较大的生物分子在填料中的保留时间短, 缓冲液中的盐和其他小分子在填料中的保留时间长。大小不同的分子因在填料中的停留 时间不同而得到分离,本产品适用于蛋白质、多糖、核酸等各种生物分子样品。也可尝 试分级分离过程分离纯化分子量差异较小的多肽、寡核苷酸、抗生素和天然产品等生物 分子。

本产品的粒径有三种规格,分别为 NUPhadex  G-25 SF Superfine ,超细粒)、 NUPhadex G-25 MMedium ,中粒)和 NUPhadex G-25 CCoarse ,粗粒)。本产品的压 力流速性能突出,SF 级可替代市面上其他 S 级(Fine,细粒)产品。不同于市面上大多 数产品只提供干粉,本产品也提供溶胀后的微球。

2 、产品特点与技术指标

 

产品名称

NUPhadex G-25 SF

NUPhadex G-25 M

NUPhadex G-25 C

目录编号

NRPB131L

NRPB131S(预装柱)

NRPB132L

NRPB132S(预装柱)

NRPB133L

NRPB133S(预装柱)

外观

乳白色凝胶微球分散液,也提供粉末。

干燥粒径范围 a μm

20~60

50~150

100~300

溶胀粒径范围 a μm

30~100

80~250

170~500

预装柱产品

中压预装柱 Y 系列

5 mL φ/h: 16 × 25 mm

重力预装柱 Z 系列(8mL  离心预装柱 L 系列(0.6 mL

中压预装柱 S 系列

53 mL φ/h: 26 × 100 mm

溶胀胶/干粉(v/wt

4~6 mL/g

球蛋白分离范围,Da

100~5000

最大流速 b cm/h

300

600

800

pH 稳定性

2~13

化学稳定性

在各种常用的缓冲液体系中均稳定,如 6 mol/L 的盐酸胍、1 mol/L 的乙酸、8 mol/L 的尿素、30%异丙醇、0.5 mol/L NaOH

灭菌

pH=7 121 ℃高压灭菌 30 min

储存与运输

2~30  ,  20%乙醇或者干粉

保质期

分散液 3 年,干粉 5 

注:a 至少 80%体积的微球在该粒径范围内;b 10 cm 柱高下的最大测试流速。


3 、使用方法参考

 

3.1  色谱柱装填

NUPhadex G-25 分子筛填料的装柱方法与琼脂糖凝胶微球类似,产品如果是干粉的 形式,则需要预先溶胀后再装填(从下述步骤 1  开始),产品如果是溶胀后分散液的形 式,则可直接装柱(从下述步骤 2 开始),避免了需要预先溶胀的过程。以下阐述与层 析系统连接时,NUPhadex G-25 填料的色谱柱装填方法。

1)溶胀

产品如果是干粉的形式,按~5 mL 缓冲液(或者水)/g 干粉的比例溶胀微球,在常 温下通常需要 3 h,升高温度则可以缩短溶胀时间。需避免使用粘度过大的缓冲液,液 体最好做脱气处理。

2)填料用量计算

通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩系数。沉降体积是指 填料在 20%乙醇保存液中自然沉降 24 h 以上读取的稳定体积,压缩系数在 1.10~1.20  间,该系数跟微球粒径和层析柱尺寸相关。最小粒径的 SF 级的压缩系数为~1.20M  ~1.15 C 级为~1.10

3)装柱填料悬液准备

将清洗好的填料转移到适当的容器中,加入填料体积的三分之一到一倍的缓冲液或 者水制成 50~75%的装柱填料悬液,使用前搅匀。

4)装填前准备

在清洗干净的层析柱下端加入蒸馏水,以除去下垫片及层析柱下端的空气,在柱内 保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。

5)装填

将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器),为避免引入 气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后,用装柱液将装柱器加满,拧 紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。

6)压柱

使柱内填料自然沉降(或低于 50 cm/h 的流速下沉降),待填料沉降完全后(填料与 液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面上约 0.5 cm 的位置; 不同粒径的微球通过不同的流速(注意柱压不超过0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵,打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置, 旋紧柱头,装柱完成。 下表为不同粒径NUPhadex G-25 的推荐压缩系数和装柱流速。

 

粒径规格

NUPhadex G-25 SF

NUPhadex G-25 M

NUPhadex G-25 C

推荐压缩系数

~1.20

~1.15

~1.10

推荐装柱流速,cm/h

~150

~400

~600

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。

3.3  上样

1)缓冲液选择:一般选用水系缓冲液,根据除盐或者换液后的缓冲体系决定,例 如磷酸钠缓冲液、Tris-HCl 缓冲液等。缓冲液中含 0.05 mol/L 的盐时,即足以消除潜在 的非特异性吸附作用。

2)样品处理:样品的缓冲液应与所选分离缓冲液一致。样品上柱前应 0.45 μm  滤。

3)上样量:用于组族分离(除盐与换液),上样量可达柱体积的 20~30%

3.4  分离

使用平衡缓冲液冲洗层析柱,通过 UV 、电导等信号监测流出组分的信息。组族

离时,一般 1.0 CV 以内可获得目标产物;分级分离时,需要 1.5 CV 收集所有的产物组 分。

3.5  再生与平衡

在第二次上样前,需要对色谱柱进行再生与再平衡。再生过程一般使用平衡缓冲液 冲洗层析柱 2~3 CV ,当流出液的电导、pH 等信号与平衡缓冲液基本一致,即可进行第 二次上样。

3.6  在位清洗

使用完的层析柱出现堵塞、压力增大、流速减慢、载量下降等情况时, 就需要进行 在位清洗。通常情况下, 推荐使用 5 次左右进行在位清洗。NUPhadex G-25 在位清洗最 常用的方法:使用完的层析柱用蒸馏水清洗 3~5 个柱体积,然后用 0.1~0.5mol/L  NaOH 溶液,清洗 2~3 个柱体积,然后用蒸馏水清洗至中性即可。同其它层析介质一样,为了 达到更好的清洗目的,可以采用反向清洗。

3.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30℃ 为宜,不可冻存。粉末需在干燥的 2~30 ℃环境中保存。

4 NUPhadex G-25 分子筛填料预装柱简介

 

4.1 NUPhadex G-25 SF pre-packed column (Y series)中压预装柱 Y 系列

超细粒的 NUPhadex G-25 SF 级产品设有 5 mL 的中压预装柱(预装柱尺寸为 φ/h: 16 × 23 mm),该预装柱可接层析设备使用,也可以接针筒注射器、蠕动泵使用,适用 于少量样品(0.1~1.5 mL)的换液或除盐,最大使用流速可大于 5 mL/min 。具体使用过 程可参照 3.3~3.7 小节。

4.2 NUPhadex G-25 M pre-packed gravity column 重力预装柱

中粒的 NUPhadex G-25 M 级产品设有 8.5 mL 的重力预装柱(内径 15.8 mm,装填 高度~4.4 cm),该预装柱可以依靠重力自流(graviy flow),也可以装适配器后在相应的 离心机中使用,最大的上样量为 2.5 mL 。依靠重力自流纯化样品的方法阐述如下。

1)填料保存在 20%乙醇中,去除重力柱的上盖后,可将保存液上清液倒出。

2)摘下下堵头,将平衡缓冲液加入重力柱中,置换填料微球中的保存液。通常 2~3 体积的缓冲液(2~3CV)可将保存液置换完全。

3)加入至多2.5 mL 样品于重力柱中,若样品不足 2.5 mL,则待样品自流完全后 补充平衡缓冲液至 2.5 mL

4)加入 3.5 mL 平衡缓冲液将目标产物洗脱,并收集。可分管收集洗脱液,并对 洗脱液的电导和 UV 吸收值等参数进行检测。

5)市面上有些重力预装柱为一次性使用产品,本产品在进行再生、清洗后可重复 使用,可参照 3.5~3.7 小节进行操作。

4.3 NUPhadex G-25 M pre-packed spin column 离心柱

中粒的 NUPhadex G-25 M 级产品还设有 0.6 mL 的离心柱产品,该离心柱可与标准 离心管配套使用,最大上样量为 180 μL 样品,使用方法参考如下。

1)将离心柱中的填料分散均匀后,用 800 g 左右的离心力离心 30~60 秒以去除保 存液,加入 400 μL 平衡缓冲液以同样的方式离心,并再重复 4 次。舍弃的保存液或者 平衡缓冲液收集在合适的离心管中。

2)更换收集离心管,在离心柱中缓慢加入至多 180 μL 样品,800 g 左右的离心 力离心 120 秒以收集样品。当样品较少时,例如少于 140 μL,加入样品后可补加平衡缓 冲液至 140 μL

3)本产品可作为一次性使用产品,也可以在进行再生、清洗后可重复使用, 可参  3.5~3.7 小节进行操作。

4.4 NUPhadex G-25 C pre-packed column (S series)中压预装柱 S 系列

粗粒的 NUPhadex G-25 C 级产品设有 53 mL 的中压预装柱(预装柱尺寸为 φ/h: 26 × 100 mm),该预装柱可接层析设备使用,最大上样量可达 15 mL,最大使用流速可达 30 mL/min。具体使用过程可参照 3.3~3.7 小节。






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