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NRPB119——Red NUPharose FF

发布日期:2024-06-04 阅读次数:83

1 、产品介绍

 

Red NUPharoseFF 是活性红 120(又称普施安红 HE-3B)活性染料键合在 NUPharose 琼脂糖微球上得到的亲和填料。活性红 120 是多环染料,与 NADP+具有结构类似性,可 用于纯化核苷酸依赖性酶、脂蛋白、 乳酸脱氢酶、纤溶酶原、肽、激素等的纯化。除了 作为亲和填料使用,本产品配基含芳香环和阴离子,也通过静电作用或者疏水相互作用 进行非亲和纯化。

2 、产品特点与技术指标

 

品名

Red NUPharose FF

目录号

NRPB119L NRPB119S(预装柱)

基质

6%交联琼脂糖

配基

活性红 120 ~2 μmol/mL

粒径范围 a

45~165 μm

平均粒径

~90 μm

动态结合载量 b

~15 mg BSA/mL

推荐工作流速

60~300 cm/h

最大流速与压力 c

>1500 cm/h 0.5 MPa

使用 pH

4~8.5(推荐的工作 pH),3~12(长期稳定);2~14(短期稳定)

化学稳定性

在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、0.5 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿素、

6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇。

储存与运输

20%乙醇,2~30 ℃

保质期

5 

注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,;c 10 cm 柱高下的最 大测试流速。



3 、使用方法参考

 

3.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。

1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。

2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Red NUPharose FF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比,可通过柱头下压的方法, 也可以通过高流速压柱。

3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3  填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。

4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。

5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的装柱液,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。

6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。

7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。

 

装柱条件

Red NUPharose FF

压缩比

1.15

装柱流速

600 cm/h

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。

3.3  平衡与上样(Equilibration & Loading

在上样前,需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。可以选择磷 酸盐、Tris-HCl 等常见的缓冲体系。

上样量可按mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10%  50~80%,例如 Red  NUPharoseFF 产品对的动态结合载量为~15 mg/mL,纯化时的上样量可为7.5~12 mg/mL 除了 DBC10%,也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进 行离心(10000 g 以上)、过滤(0.22  0.45 μm)处理,以免堵塞色谱柱。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

3.5  洗脱(Elution

通常在缓冲液 A 中添加 3 M NaCl 或者 2 M KCl 可将目标蛋白洗脱。

3.6  再生(Regeneration

纯化后可用弱酸和弱碱性缓冲液交替冲洗色谱柱 3~4  次,进行填料再生,例如 0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaClpH4.5)和 0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaClpH8.5)。 然后用平衡缓冲溶液平衡。

3.7  在位清洗(CIP

通常上述的洗脱和再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染,可采用以下溶剂进行在位清洗:0.1~0.5 mol/L NaOH70%乙醇或 30%异丙醇等。 在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除去 上述溶剂。

3.8  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用 20%乙醇并添加 0.5 M NaCl  存。保存温度在 2~30 ℃为宜,不可冻存。




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