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NRPB117 & NRPB118——Blue NUPharose FF&NuPerley Blue

发布日期:2024-06-04 阅读次数:92

1 、产品介绍

         NRPB117 & NRPB118——Blue NUPharose FF和NuPerley Blue染料亲和填料

Blue NUPharoseFF 是一种染料亲和填料,通常称为蓝胶,在纽龙生物经典的琼脂糖 凝胶层析介质基球 NUPharose 上键合汽巴蓝 F3GA 而成。Blue NUPharose FF 的配基为 三嗪类活性染料,特殊的结构决定了其与蛋白结合的复杂性,一般认为其通过静电相互 作用、疏水相互作用以及氢键等作用力与蛋白结合,适用于脱氢酶、激酶、血浆类蛋白 等的分离纯化。

2 、产品特点与技术指标

 

产品名称

Blue NUPharose FF

NuPerley Blue

目录编号

NRPB117L

NRPB117S(预装柱)

NRPB118L

NRPB118S(预装柱)

基质

6%交联琼脂糖

高刚性琼脂糖凝胶

配基

汽巴蓝 F3GA ~8 μmol/mL

汽巴蓝 F3GA ~15 μmol/mL

粒径范围 a

45~165 μm

30~100 μm

平均粒径

~90 μm

~60 μm

动态结合载量 b

~20 mg BSA/mL

~30 mg BSA/mL

推荐工作流速

60~300 cm/h

60~300 cm/h

最大流速与压力 c

>1500 cm/h 0.3 MPa

>1500 cm/h 0.5 MPa

使用 pH

4~8.5(推荐的工作 pH),4~12(长期稳定);3~13(短期稳定)

化学稳定性

在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、0.5 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿素、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇。

储存与运输

2~8 °C 20%乙醇,0.1 mol/L KH2PO4 pH 8.0

保质期

3 

注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,4 min 停留时间;c 10 cm 柱高下的最大测试流速。

3 、染料亲和层析原理

 

Blue NUPharose FF 配基的特殊结构决定了其对蛋白质的吸附是一个复杂的过程。 除对蛋白质分子上的二核苷酸链具有亲和作用外,其蒽醌杂环与蛋白质分子非极性面之 间存在疏水作用,芳香环上的磺酸基又使其具有离子交换基团的性质,可能导致蛋白与 配基之间存在非均一结合。

因此对于不同的蛋白及配基和蛋白之间的结合情况也不尽相同。以 BSA 为例,pH 值的变化对其在 Blue NUPharose FF 上的吸附影响非常显著。随着 pH 值的升高,吸附 容量急剧下降。主要原因是随着 pH 值的升高,蛋白质分子上带有正电荷的区域将减小, 导致与染料之间的静电相互作用减弱,所以吸附量降低。当 pH 值在 5.5~8.0 降低时,蛋 白质吸附容量的提高主要是由蛋白质分子中组氨酸残基引起的。而 BSA 分子中具有较 高水平的组氨酸残基含量(17 个组氨酸残基/581残基),所以吸附量随 PH 值的变化比较 显著。




4 、使用方法参考

 

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。

1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。

2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Blue NUPharoseFF 的压缩比为 1.15。为使达到装柱比,可通过柱头下压的方法, 也可以通过高流速压柱。

3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽滤除去液体,并用约 3  填料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。

4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液,使用前搅匀。

5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的装柱液,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。

6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。

7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。

装柱条件

Blue NUPharose FF

压缩比

1.15

装柱流速

600 cm/h

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价.

4.3  平衡与上样(Equilibration & Loading

结合缓冲液

常见的磷酸盐、醋酸盐等均可作为结合缓冲液,需根据样品特点选择合适的结合缓 冲液(记为缓冲液 A)。根据第 3 章节的染料亲和层析原理,适当低的 pH 的结合缓冲液 能促进蛋白的结合,一般情况下 pH  范围在 5.5~8.0 之间宜。

实际使用过程中,上样料液的体积往往较大,在上样前,需用缓冲 A 在操作流速 下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参 数不变且与缓冲液 A 对应为准。

上样量可按mg  目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10%  50~80%,例如 Blue  NUPharose FF 产品对 BSA  DBC10%~20 mg/mL,纯化时上样量可为 10~16 mg/mL 除了 DBC10%,也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进 行离心(10000 g 以上)、过滤(0.22  0.45 μm)处理,以免堵塞色谱柱,样品的 pH  与上样缓冲液保持一致。

上样后需要 3~10 个柱体积的缓冲液 A 再平衡层析柱。

4.4  洗脱(Regeneration

染料亲和的样品多种多样,亲和原理较为复杂,相应的洗脱方式也需随样品不同而 改变。通常可以改变缓冲液的 pH 、离子强度(例如添加 2 M NaCl)和极性(例如添加 50%乙二醇)。纯化酶时可加入低浓度的辅因子进行竞争洗脱。

4.5  再生(Regeneration

可以采用高 pH0.1MTris0.5 M NaClpH 8.5)和低 pH0.1MNaAc0.5M NaCl pH 4.5)交替清洗 4~5 次去除结合较强的蛋白质使层析柱再生。

4.6  在位清洗(CIP

通常上述的再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高,或为了避免交叉污染, 将金属离子剥离后可进行在位清洗过程。可采用以下溶剂进行在位清洗:2 mol/L NaCl  1 mol/L NaOH 70%乙醇或 30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效 果更佳。清洗后需用 3~5  柱体积的纯水除去上述溶剂。

4.7  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇,0.1 mol/L KH2PO4pH 8.0。使用过后可继续相同的 溶液保存。保存温度在 2~8 ℃为宜,不可冻存。




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