1 、产品介绍
NRPB22、NRPB99 & NRPB101——Q NUPharose FF、Q NUPharose HP和Q NUPharose BB强阴离子填料
Q NUPharose 系列是强阴离子交换填料,Q 为季铵基,NUPharose 为纽龙生物经典 的琼脂糖凝胶层析介质基球。与市面上的其他 Q 填料相比,本产品具备非特异性吸附 少,动态结合载量受停留时间影响小等特点,广泛应用于生物大分子分离纯化的捕获、 中度纯化和精纯等步骤。
根据分辨率和适用场合不同,Q NUPharose 系列可分为 Q NUPharoseFF(~90 μm)、 Q NUPharose HP(~35 μm)、Q NUPharose BB(~200 μm)三款。FF 为 Fast Flow 的缩 写,Q NUPharoseFF 具备快流速的特点,可用于快速纯化蛋白质,适用性广,易于放大。 HP 为High Performance 的缩写,Q NUPharose HP 具备分辨率高的特点,多用于精纯阶 段。BB 为 Big Beads 的缩写,Q NUPharose BB 的粒径大,适用于高粘度体系,如血液 制品,也可用于分批静态操作。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Q NUPharose FF | Q NUPharose HP | Q NUPharose BB |
目录编号 | NRPB22L、 NRPB22S(预装柱) | NRPB99L、 NRPB99S(预装柱) | NRPB101L、 NRPB101S(预装柱) |
基质 | 6%交联琼脂糖 | ||
功能基团 | 季铵基,-CH2CH(OH)CH2N(CH3)3+ | ||
粒径范围 a | 45~165 μm | 20~60 μm | 100~300 μm |
平均粒径 | ~90 μm | ~35 μm | ~200 μm |
离子交换容量 | 110~160 μmol OH-/mL | 60~100 μmol OH-/mL | 110~160 μmol OH-/mL |
动态结合载量 | ≥40 mg/mLb ≥110 mg/mLc | ≥80 mg/mLb | ≥50 mg/mLb |
推荐工作流速 | 150~300 cm/h | 60~150 cm/h | 150~300 cm/h |
最大流速 c | 1200 cm/h | 300 cm/h | 1200 cm/h |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、1 M 氢氧化钠、8 M 尿素、6 M 盐酸 胍、70%乙醇、30%异丙醇等。 | ||
pH 稳定性 | 3~12(推荐的工作 pH),3~12(长期稳定);2~14(短期稳定) | ||
储存与运输 | 20%乙醇,2 ℃~30 ℃ | ||
保质期 | 5 年 |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,牛血清白蛋 白,2 min 停留时间;cDBC10%测试条件为:10%流穿,重组人表皮生长因子(纽龙生物, NRPA11S),2 min 停留时间;10 cm 柱高下的最大测试流速。
3 、阴离子交换填料工作原理
离子交换层析是带电荷的目标分子与离子交换层析介质进行离子交换的分离纯化 过程,主要依赖电荷相互作用,利用带电分子的差异进行分离。因所有生物分子都是极 性的,在一定条件下均可带电荷,以蛋白质为例,当溶液 pH 高于蛋白质的等电点(PI) 时,蛋白质分子带负电荷,则可以与阴离子交换填料进行离子交换而结合。不同分子的 带电量不同,与层析介质的结合牢固程度不同,通过调控洗脱条件可以将不同分子先后 洗脱下来,从而达到分离纯化的目的。
图 1 是典型的阴离子交换层析过程示意图,阴离子交换层析是指层析介质可以与溶 液中的阴离子进行离子交换。Q 基团的电离度大,是强碱性离子交换剂,因而本产品被 称为强阴离子交换填料。当填料处于平衡状态时,Q 阴离子周边是带负电荷的对离子, 通常是 Cl-。在与目标分子进行离子交换而结合的过程中, 带负电的分子被结合,不带电 或者带正电的分子未被结合,达到了初步分离的效果。阴离子交换层析可以通过提高流 动相的离子强度或者降低 pH 的方式将目标分子洗脱。提高流动相的离子强度是竞争洗 脱的过程(图 1a),流动相的离子强度提高后,负电荷与目标分子竞争成为 Q 基团的对 离子,根据电荷的多少和结合的牢固程度,不同的分子被先后洗脱下来,从而达到纯化 的效果。另外一方面,目标分子所带的电荷与环境的 pH 相关,降低 pH 后,带负电的 目标分子所带电荷数量减少(图 1b),与介质结合的牢固程度降低,因此降低 pH 也是 阴离子交换层析的一种洗脱方式。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。Q NUPharoseFF 的推荐压缩比为~1.15 , Q NUPharoseBB 的推荐压缩比为~1.10 , Q NUPharose HP 的推荐压缩比为~1.20。为达到压缩比,可通过柱头下压的方法,也可 以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:将填料悬液充分摇匀后量取相应体积,抽去液体,并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤,重复 3 次,以除去保存液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成 50~75 v%的装柱填料悬液(原包装中填料体积分数为67%),使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后, 需用高流 速平衡柱内的填料。
装柱条件 | Q NUPharose FF | Q NUPharose HP | Q NUPharose BB |
压缩比 | ~1.15 | ~1.20 | ~1.10 |
装柱流速 | ~600 cm/h | ~150 cm/h | ~600 cm/h |
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后,使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样(Equilibration & Loading)
使用阴离子交换填料时,常用的缓冲液有 Tris-HCl、乙醇胺、组氨酸等缓冲体系, 浓度为~20 mM 为宜。不含其他盐的上述缓冲液称为平衡缓冲液,记为缓冲液 A。缓冲 液 A 的特点为低盐,pH 至少高于目标蛋白等电点一个单位。
在上样前,需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱,该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A,以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。
离子交换填料中最常用的纯化模式为“结合模式(binding)”,即目标蛋白与填料进 行离子交换后结合,杂质则流穿。在有些场合,也会使用“流穿模式(flowthrough)”, 即杂质与填料结合,目标蛋白流穿,该模式更多用于中度或者精纯阶段。
样品通常溶于上述缓冲液 A,或者将样品溶液进行换液处理,置换成缓冲液 A 体 系。上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10% 的 50~80%,例如 Q NUPharoseFF 产品对重组人表皮生长因子(rh-EGF)的 DBC10%为~100 mg/mL,纯化 rh- EGF 时的上样量可为 50~80 mg/mL。除了 DBC10%,也可以测试上样流穿液中的目标蛋 白确定上样量。
4.4 冲洗(Wash)
用 3~10 个柱体积的平衡液 A 冲洗上样后的层析柱,观察检测器的变化,直到电导、pH 等参数不变,此时未交换的组分被清洗出去。
4.5 洗脱(Elution)
最常用的洗脱方式为提高洗脱液中 NaCl 的浓度(在缓冲液 A 中加入 NaCl),推荐 在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于一些场合,也可以改变 pH 或者同时改变离子强度和 pH 进行洗脱,通过优化洗脱条件可以提高层析的效果。
4.6 再生(Regeneration)
可用更高离子强度的 NaCl 溶液(1~2 M NaCl)将结合牢固、未被洗脱的蛋白洗脱, 对填料进行再生,本产品在再生后可使用多次。也可以改变 pH 或者同时改变离子强度 和 pH 进行再生。再生后需要用缓冲液 A 平衡。
4.6 在位清洗(CIP)
若有蛋白沉淀、脂蛋白或疏水蛋白与填料结合无法在上述过程中洗脱, 则需在位清 洗除去。可采用以下选择进行在位清洗:1 M NaOH、70%乙醇、30%异丙醇等。需用~2.5 CV 的溶液进行在位清洗,接触时间~30 min。在位清洗后需要用缓冲液 A 平衡。
4.7 填料保存
填料的初始保存液为 20%乙醇,使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在 2~30℃ 为宜,不可冻存。