4 、使用方法参考

4.1  色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。CM NUPharose FF 的压缩比为~1.15 ，CM NUPharose HP 的压缩比为~1.20。为达 到压缩比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽去液体，并用约 3 倍填 料体积的纯化水洗涤，重复 3 次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液（原包装中填料体积分数为67%），使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下 端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器）， 为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后， 用装柱液将装柱 器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降 完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处； 通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过 0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定， 标记界面稳定时的柱高。停泵， 打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后， 需用高流 速平衡柱内的填料。

4.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

4.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

使用阳离子交换填料时，常用的缓冲液有磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等缓冲体系， 浓度为~20 mM 为宜。不含其他盐的上述缓冲液称为平衡缓冲液，记为缓冲液 A。缓冲 液 A 的特点为低盐，pH 至少低于目标蛋白等电点一个单位。

在上样前，需用缓冲液 A 在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要 5~10 个柱体 积的缓冲液 A，以电导、pH 等检测信号参数不变且与缓冲液 A 对应为准。

离子交换填料中最常用的纯化模式为“结合模式（binding）”，即目标蛋白与填料进 行离子交换后结合，杂质则流穿。在有些场合，也会使用“流穿模式（flowthrough）”， 即杂质与填料结合，目标蛋白流穿，该模式更多用于中度或者精纯阶段。

样品通常溶于上述缓冲液 A，或者将样品溶液进行换液处理，置换成缓冲液 A 体 系。上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定，通常为 DBC10% 的 50~80%，例如 CM NUPharose FF 产品对溶菌酶的 DBC10%为~90 mg/mL，纯化 BSA 时的上样量可为45~72 mg/mL。除了 DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。

4.4  冲洗（Wash）

用 3~10 个柱体积的平衡液 A 冲洗上样后的层析柱，观察检测器的变化，直到电导、 pH 等参数不变，此时未交换的组分被清洗出去。

4.5  洗脱（Elution）

最常用的洗脱方式为提高洗脱液中 NaCl 的浓度（在缓冲液 A 中加入 NaCl），推荐 在 0~500 mM 范围内进行阶跃洗脱或者线性梯度洗脱。对于一些场合，也可以改变 pH 或者同时改变离子强度和 pH 进行洗脱，通过优化洗脱条件可以提高层析的效果。

4.6  再生（Regeneration）

可用更高离子强度的 NaCl 溶液（1~2 M NaCl）将结合牢固、未被洗脱的蛋白洗脱， 对填料进行再生，本产品在再生后可使用多次。也可以改变 pH 或者同时改变离子强度 和 pH 进行再生。再生后需要用缓冲液 A 平衡。

4.7  在位清洗（CIP）

若有蛋白沉淀、脂蛋白或疏水蛋白与填料结合无法在上述过程中洗脱， 则需在位清 洗除去。可采用以下选择进行在位清洗：1 M NaOH、70%乙醇、30%异丙醇等。需用~2.5 CV 的溶液进行在位清洗，接触时间~30 min。在位清洗后需要用缓冲液 A 平衡。

4.8  填料保存

填料的初始保存液为 20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇保存。保存温度在4~30 ℃ 为宜，不可冻存。