1 、产品介绍
Phenyl NUPharose FF 和 Phenyl NUPharose FF (LS)是将苯基以稳定的醚键键合在琼 脂糖凝胶微球上形成的疏水层析分离介质,NUPharose 是纽龙生物开发的经典琼脂糖基 础微球。苯基的疏水性较强,与芳香族氨基酸残基之间存在疏水、π-π 相互作用,适合 用于目标蛋白的捕获和中度纯化。Phenyl NUPharoseFF 的配基密度比 Phenyl NUPharose FF (LS)高,因而有不同的疏水性,表现出对样品不同的选择性,用户可根据具体使用场 景选择合适的产品型号。苯基填料典型应用有重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(GM- CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人集落刺激因子(M-CSF)、表皮生成因子(EGF)的 生产以及单克隆抗体的纯化。
2 、产品特点与技术指标
产品名称 | Phenyl NUPharose FF | Phenyl NUPharose FF (LS) |
目录编号 | NRPB31L 、NRPB31S(预装柱) | NRPB100L 、NRPB100S(预装柱) |
基质 | 6%交联琼脂糖 | |
配基 | 苯基,~45 μmol/mL | 苯基,~25 μmol/mL(低取代度) |
粒径范围 a | 45~165 μm | |
平均粒径 | ~90 μm | |
动态结合载量 b | ≥35 mg/mL | ≥30 mg/mL |
推荐工作流速 | 150~300 cm/h | |
最大流速与压力 c | 1200 cm/h ,0.3 MPa | |
pH 稳定性 | 3~13(长期操作过程),2~14(CIP 等短时间操作过程) | |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、1 mol/L 氢氧化钠、8 mol/L 尿 素、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇等。 | |
储存与运输 | 20%乙醇,2~30 ℃ |
注:a90%体积以上的微球在此粒径范围;bDBC10%测试条件为:10%流穿,牛血清白 蛋白,1.7 M 硫酸铵;c 10 cm 柱高下的最大测试流速。
3 、疏水层析原理
尽管疏水层析的原理较为复杂,但和其他层析一样,都是利用样品分子在填料上保留值大小不同和在用流动相洗脱时各组分迁移速度的不同,达到分离纯化的目的。图 1 简要地阐述了疏水层析过程,疏水填料的疏水配基表面有一层水分子有序排列的水化膜。 蛋白质分子含不同数量的丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及脯氨酸等非极性氨基酸残基,蛋 白质分子内部有疏水核,外部包围了大量的亲水基团,使得其表面亲水性很强,但也有 一些疏水性基团,其表面也有一层水化膜。当溶液处于高盐浓度时,水化膜被破坏,蛋 白质疏水基团暴露增多。层析介质的疏水配基与蛋白质分子之间的疏水作用增加,从而 结合目标蛋白。该过程与蛋白质盐析过程有相似之处。降低盐浓度后,层析介质的疏水 配基和蛋白质分子表面的逐步形成水化膜,两者之间的疏水作用减弱,从而洗脱蛋白。
各种生物大分子的疏水性不同,疏水基团也不同,与不同疏水配基、不同疏水配基 密度的层析介质之间的相互作用不同,选择合适的层析条件可以将不同的分子分离。
4 、使用方法参考
4.1 色谱柱装填
以下阐述与层析系统连接时,填料的色谱柱装填方法。
(1)所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样,液体最好做脱气处理。
(2)填料用量计算:通过沉降定量填料体积,需要的沉降填料体积=柱体积×压缩 比(也称压缩因子)。沉降体积是指填料在 20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定 体积。苯基疏水填料的压缩比为 1.15 。为使达到装柱比,可通过柱头下压的方法,也可 以通过高流速压柱。
(3)填料清洗:疏水填料无需清洗,可直接用保存液装柱,用 10~20%的乙醇作为 装柱液。
(4)装柱填料悬液准备:将填料转移到适当的容器中,加入适量的装柱液,制成
50~75 v%的装柱填料悬液(原包装中填料体积分数为67%),使用前搅匀。
(5)装填前准备:在清洗干净的层析柱下端加入装柱液,以除去下垫片及层析柱下 端的空气,在柱内保留少量的蒸馏水,拧紧下堵头,调整柱子使其垂直于地面。
(6)装填:将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内(必要时使用装柱器), 为避免引入气泡,应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后, 用装柱液将装柱 器加满,拧紧装柱器上盖,将柱子与层析系统连接。
(7)压柱:使柱内填料自然沉降(或 50~150 cm/h 的低流速下沉降),待填料沉降 完全后(填料与液体的界面清晰),去除装柱器,装上上柱头,并将柱头下降至界面处; 通过高流速(推荐流速见下表,注意柱压不超过 0.3 MPa),继续压柱至界面清晰稳定, 标记界面稳定时的柱高。停泵, 打开柱头上的阀门/堵头,关闭柱底的阀门/堵头,下压柱 头至标记位置下方与压缩比对应的位置,旋紧柱头,装柱完成。装柱完成后,需用高流 速平衡柱内的填料。
4.2 柱效测定和评价
完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用 理论塔板高度(HETP)和非对称因子(As)来评价。
4.3 平衡与上样(Equilibration & Loading)
在上样前,需用平衡缓冲液在操作流速下平衡层析柱,观察检测器的变化,直到电 导、pH 等参数不变。磷酸盐-硫酸铵溶液是最常用的疏水层析盐溶液体系,也可以根据 盐析原理选择其他盐。
疏水层析过程一般采取“高盐上样、低盐洗脱”的模式,样品的预处理通常有置换 缓冲液、加盐、过滤(0.45 、0.22μm)等过程。
上样量可按“mg 目标蛋白/mL 填料”来设定,通常为 DBC10% 的 50~80%,例如 Phenyl NUPharose FF 产品对牛血清白蛋白的 DBC10%为~35 mg/mL,纯化牛血清白蛋白的上样 量可为 17.5~28 mg/mL。除了 DBC10%,也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样 量。
4.4 洗脱(Elution)
用 2-3 个柱体积的平衡缓冲液冲洗上样后的层析柱,观察检测器的变化,直到电导、 pH 等参数不变,此时结合的组分被清洗出去。
疏水层析柱的洗脱可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱, 一般推荐降低盐浓度的 梯度洗脱进行。亦可根据实际情况,添加有机溶剂进行洗脱。
4.5 再生(Regeneration)
用蒸馏水按操作流速冲洗 3-5 个柱体积,接着用平衡液洗到平衡 3-5 个柱体积。 若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉,可用在位清洗(CIP)除去。
4.6 在位清洗(CIP)
可采用以下选择进行在位清洗:0.5~1 mol/L NaOH、8 mol/L 尿素和 30%异丙醇等。 在位清洗可有效去除介质上的杂质,反向效果更佳。