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Strep-tag纯化系统进化史

发布日期:2024-01-22 阅读次数:163

高效的纯化、检测、固定化或分离在现代蛋白研究领域至关重要,特别是在结构基因组学和蛋白组学领域。使用经济、简单且可靠的方法快速分离重组蛋白(特别是在高通量筛选的实验条件下),有助于快速对其生物活性进行表征,识别其相互作用的物质。Strep-tag 作为一种用于亲和纯化的短肽标签,与重组蛋白进行融合表达后,可以进一步用于分离纯化。

一、Strep-tag发展史

Strep-tag 是从随机文库中筛选得到的9个氨基酸的短肽( AWRHPQFGG) ,可与链霉亲和素(SA)进行可逆结合。当用作标签时,可以与重组蛋白实现融合表达,进而通过SA亲和层析柱一步纯化重组蛋白。Strep-tag 短肽骨架表现为螺旋构象( HPQFG) ,其中8个氨基酸残基( WRHPQFGG) 参与亲和作用,C-末端甘氨酸的游离羧基可与链霉亲和素R84形成盐桥,因而Strep-tag与蛋白融合表达时被限制在C端。由于SA与Strep-tag的结合位点同其与生物素的结合位点基本一致,故而Strep-tag可以与生物素竞争性的结合SA

通过将 Strep-tag与目的蛋白融合表达,利用填料吸附带有Strep-tag的重组蛋白,再利用生物素竞争洗脱,获得目的蛋白。但由于Strep-tag 仅可结合在目的蛋白的C端,且其对链霉亲和素的亲和力较弱,因此未得到广泛的应用。

在对Strep-tag的氨基酸序列进行优化和修改后,科研工作者开发了更合适的短肽标签Strep-tag  (WSHPQFEK)Strep-tag 是一个由8个氨基酸组成的短肽,其序列为Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,不仅可以结合在蛋白的C,也可以结合在蛋白的N端。此外,Strep-tag 对蛋白的折叠或生物活性不产生影响,也不会诱导蛋白聚集,因此后续实验一般无需去除。

做图6.png

在随后的研究工作中,科研工作者发现如果目标蛋白表达量很低Strep-tag 纯化系统不能快速对蛋白进行纯化,于是对其进一步进行了改造,用linker将两个Strep-tag 连接在一起,开发出Twin-Strep-tag也有叫双Strep-tag )。Twin-Strep-tag具有特异性高、一步纯化纯度高、纯化过程条件温和、蛋白两端均可融合等特点,改善了低浓度样本纯化效果,还能用于捕捉蛋白复合体、检测蛋白间的相互作用。

做图1.png

二、 基于Strep-tag的SA改造

最初Strep-tag被开发出来时,其与SA的亲和力相较于生物素较弱,较弱的亲和力虽可在相对温和的条件下进行竞争性洗脱,但也限制了其对标签蛋白的捕获,且在较弱的相互作用下,不能保证Strep-tag可以与配基充分结合。因此,需要对SA进行进一步改造,以满足Strept-tag纯化系统的需要。

Strep-TactinSA的氨基酸序列进行重构和改造而来的,通过对靠近结合位点的一个环区中的多个氨基酸进行突变,从而获得有活性且与Strep-tag Ⅱ亲和能力增SA突变体,即Strep-Tactin。相较于SAStrep-Tactin  Strep-tag Ⅱ 结合更加紧密,能够在温和的条件下与Strep-tag 融合蛋白进行结合和解离。而且由于Strep-TacinStrep-tag 具有高度特异性,一般一步纯化就能获得高纯度的蛋白样品(图1,被广泛应用于蛋白纯化或检测中,以及某些细胞分离检测领域。一般选用脱硫生物素进行竞争性洗脱即可,利用2-(4-羟基苯唑苯甲酸(HABA)溶液可实现Strep -Tactin填料的再生。

图1.png

但是,Strep-Tactin也有一定的局限之处,比如,在变性条件下并不稳定,无法进行纯化,且进行批量纯化时,即使搭配Twin-Strep-tag,效果仍不尽人意。因此对Strep-Tactin进行进一步改造后,得到与Twin-Strep-tag亲和力更高的Strep-tactin2。同时,因亲和力增加,即使经过多次清洗步骤,目的蛋白也不会从Strep-Tactin2上解离,从而提高了目标蛋白的得率。2018年,中南大学湘雅二医院的科研工作者通过将 Strep-tag 融合在目标蛋白的C端,利用这一亲和纯化系统,首次从哺乳动物细胞中分离纯化得到了TMEM8B-a蛋白,并验证该蛋白在抑制肿瘤细胞侵袭转移中发挥重要作用。

TMEM8B-a蛋白的三级结构图.png

  TMEM8B-a蛋白的三级结构图

    Strep-tag系统的发展过程由Strep-tag到Strep-tag 再到Twin-Strep-Tag,其与SA的亲和力和特异性逐渐增强,与之相关的亲和纯化填料由Strep-Tactin 到改造后的Strep-Tactin 2 ,其与Strep-tag系列短肽标签的亲和力也逐渐增强。

雷达图制作.png

       纽龙生物通过自有的蛋白定向进化及发酵生产平台,对SA进行了一系列改造及优化,具有多达数十种SA突变体的蛋白文库。基于自有填料研发平台,利用重组Strep-Tactin 2开发出用于Strep-tag纯化系统的亲和纯化填料。

Strep-Tactin 2 NUPharose FF(NRPB61L)在用于纯化带Strep-tag Ⅱ 和Twin-Strep-tag 的重组蛋白时,具有如下优势:

高选择性:Strep-Tactin 2 对标签的选择性大大提高,无论是Strep-tag  还是Twin-Strep-tag,都能够实现较好的纯化效果,一般只需一步纯化就能获得高纯度的蛋白质样品。

高结合载量:通过对配基设计进行改进,进一步提高了对标签的亲和力,并且削弱了与生物素的亲和力,从而能够更牢固的结合重组蛋白,动态结合载量可以达到10 mg/mL

高耐受性:通过对配基、偶联、填料的优化改造,提升了对某些蛋白变性剂、表面活性剂的耐受性。

经济性:在洗脱方面,可以使用生物素进行洗脱,相对昂贵的脱硫生物素更经济。

[1] Skerra A,Schmidt TG.Use of the Strep-Tag and streptavidin fordetection and purification of recombinant proteinsJ.Methods Enzymol,2000,326: 271-304

[2] Schmidt, Thomas G. M. , et al. "Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. " Journal of Molecular Biology 255.5(1996):753-766.

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[4] 张檬,罗棉兴,陈国.链霉亲和素及其亲和系统的蛋白质进化[J].中国生物化学与分子生物学报, 2019, 35(7):8.DOI:CNKI:SUN:SWHZ.0.2019-07-004.




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